Diversidade genética de lactobacilos isolados de dentina cariada antes e após selamento

Abstract

Existe hipótese de que haja seleção de bactérias abaixo das restaurações devido a escassez de nutrientes. Por isso o objetivo do trabalho foi avaliar o efeito do selamento de lesões dentinárias de cárie sobre a diversidade genotípica de Lactobacilos utilizando a técnica de AP-PCR. Dezoito pacientes com lesões dentinárias em terço médio de dentina foram submetidos à remoção parcial de tecido cariado e selamento da cavidade por 3 meses. Amostras de dentina foram obtidas antes e após o selamento e cultivadas em Ágar Rogosa, por 72 horas em anaerobiose. Até sete cepas de cada tipo morfológico foram selecionadas e armazenadas em caldo de Brain Heart Infusion (BHI) e glicerol (15%) em -20º C. As amostras foram analisadas quanto à coloração de Gram e morfologia. Somente bacilos e cocobacilos gram-positivos foram mantidos na amostra. Os isolados foram também identificados pelo sequenciamento dos genes pheS/rpoA. Do total de 18 pacientes, seis apresentaram crescimento de Lactobacilos antes e após selamento. Assim, a amostra final foi de 93 isolados (44 antes do selamento e 49 depois do selamento). Para a avaliação da diversidade genética, os isolados foram replicados em BHI ágar, cultivadas por 24 horas a 37ºC . Para extração do DNA as colônias foram suspensas em 50μl de água ultrapura estéril. A técnica de AP-PCR foi realizada utilizando o primer OPA3. Lactobacillus ATCC (L. rhamnosus ATCC 7469) água ultrapura foram utilizadas como controle positivo e negativo, respectivamente. Os produtos de AP-PCR foram analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%, corado com SybrGreen 1.6%, a 96 V durante 4 h. As imagens dos géis de AP-PCR foram capturadas por uma câmera digital (Canon Inc., Tóquio, Japão) e armazenadas no formato de arquivo de imagem para análise visual. Na análise dos amplicons, os Lactobacilos do mesmo paciente antes e depois do selamento foram sempre analisados no mesmo gel. Dois examinadores cegos e calibrados realizaram a análise visual. Um total de 43 genótipos distintos foi identificado. Teste t-pareado foi utilizado para comparar a media do número de genótipos encontrados antes e depois do selamento considerando 5% de significância. A média do número de genótipos por paciente foi de 5,17±5,49 e 2,67±2,25 (p=0,344) antes e depois do selamento, respectivamente. O menor número de bandas obtidas pela análise dos géis de AP-PCR foi 2 e o maior foi 15. A média de número de bandas foi 8.72±2.22. Um total de 31 e 16 genótipos diferentes foram encontrados antes e depois do selamento, respectivamente. Houve uma tendência de diminuição da diversidade de Lactobacilos após o período de selamento.

An hypothesis exists that a selection of bacteria underneath restoration due to a limited access of nutrients. Therefore the aim of this study was to evaluate the effect of carious sealing in genotypic diversity of Lactobacillus using the AP-PCR technique. Eighteen patients with dentine lesions, in the middle third of dentin, were submitted to partial caries removal and sealing for 3 months. Dentin samples were obtained before and after sealing and cultured on Rogosa Ágar for 72 hours under anaerobic conditions. Up to seven strains of each morphological type were selected and stored in Brain Heart Infusion (BHI) broth and glycerol (15%) at -20º C. The samples were analyzed for Gram staining and morphology. Only gram-positive rods and coccobacilli were selected . The isolates were identified by sequencing of genes pheS/rpoA. From a total of 18 patients, six showed growth of Lactobacillus before and after sealing. The final sample comprised 93 isolates (44 before sealing and 49 after sealing). To evaluate the genotypic diversity, the isolates were replicated in BHI Ágar and cultured for 24 hours at 37º C. For DNA extraction, colonies were suspended in 50μL of sterile ultrapure water. The technique of AP-PCR was performed using primer OPA3. Lactobacillus ATCC (L. rhamnosus ATCC 7469) and ultrapure water were used as positive and negative controls, respectively. The AP-PCR products were analyzed by gel electrophoresis in 1% agarose, stained with SybrGreen 1.6% at 96 W for 4 h. The images of the AP-PCR gels were captured by a digital camera (Canon Inc., Tokyo, Japan) and stored in the image file format for visual analysis. In the analysis of amplicons, Lactobacillus from the same patient before and after the sealing always were resolved on the same gel. Two examiners blind and calibrated performed the visual analysis. A total of 43 different genotypes were identified. Paired t-test was used for compare the mean of number of genotypes found before and after sealing considering 5% of significance. The mean of genotypes found by patient were 5.17±5.49 and 2.67±2.25 (p=0.344) before and after sealing, respectively. The smallest number of bands obtained by the analysis of the gels with AP-PCR was 2 and highest was 15. The average number of bands was 8.72 ± 2.22. A total of 31 and 16 different genotypes were found before and after sealing, respectively. It was found a tendency of decrease genotypic diversity of Lactobacillus before sealing showed a tendency of decreased in diversity after sealing.