Diversidade de bactérias cultiváveis em pomares de macieiras sob diferentes tipos de manejo e obtenção de clones metagenômicos indutores de resistência sistêmica induzida nessa cultura

Abstract

O sistema de produção convencional adotado para macieira depende de recursos não-renováveis, como fertilizantes, além de uma quantidade excessiva de inseticidas. Felizmente esse sistema convencional está sendo substituído, por um número crescente de produtores de maçã na região serrana catarinense, por um sistema de produção orgânico. Bactérias promotoras de crescimento de plantas (PGPB-Plant Growth-Promoting Bacteria) são bactérias encontradas no solo e na rizosfera de plantas hospedeiras. Estas bactérias também desempenham um papel importante no controle biológico, uma vez que podem induzir resistência sistêmica contra vários agentes patogênicos. Esse estudo teve dois objetivos principais: 1) avaliar a diversidade de bactérias cultiváveis isoladas da rizosfera e raízes de macieiras cultivadas sob diferentes sistemas de plantio na região sul do estado de Santa Catarina; e 2) realizar a prospecção de clones metagenômicos capazes de induzir resistência sistêmica em macieiras contra o fungo Colletotrichum gloeosporioides, agente causal da doença da mancha foliar. Para o primeiro objetivo, amostras de solo rizosférico e raízes de macieiras foram coletadas de pomar orgânico e convencional, juntamente com amostras de uma área nunca utilizada para agricultura (campo nativo). As bactérias foram identificadas em nível de gênero por PCR-RFLP e sequenciamento parcial do gene do 16S rRNA e foram avaliadas em relação a diversas características de promoção de crescimento vegetal. Entre as 300 linhagens isoladas, 214 foram capazes de produzir sideróforos, 36 foram capazes de solubilizar fosfatos e 21 produziram uma grande quantidade de compostos indólicos. Sessenta e nove isolados também apresentaram alguma atividade antagonista contra o fungo fitopatogênico Colletotrichum gloeosporioides. Entre os gêneros bacterianos mais abundantes destacaram-se linhagens pertencentes a Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp. e Raoultella sp. Um experimento in vivo foi conduzido com cinco isolados e o fungo C. gloeosporioides tendo sido observado que o isolado 89, identificado como Burkholderia sp., foi capaz de reduzir os efeitos patogênicos nas plantas inoculadas. Os resultados obtidos permitiram inferir como a atividade humana está afetando as comunidades bacterianas do solo associadas aos sistemas de cultivo de macieiras, bem como obter isolados capazes de inibir o crescimento de um patógeno importante para esta cultura. Em relação ao segundo objetivo, amostras de solo rizosférico de macieiras cultivadas em pomares orgânicos e convencionais no município de São Joaquim/SC foram coletadas e o DNA metagenômico foi extraído. Para a confecção das bibliotecas metagenômicas foi utilizado o kit CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE). Até o momento, 160 clones foram testados quanto à atividade antagônica contra o fungo C. gloeosporioides em ensaios in vitro. Entretanto, nenhum destes 160 clones foi capaz de inibir o crescimento do micélio fúngico. Com o advento da metagenômica, micro-organismos não cultiváveis do solo poderão ter seu DNA e/ou parte dele desvendado, e, assim, obter uma gama imensurável de biomoléculas para serem utilizadas com fins biotecnológicos na cultura da maçã. Dessa forma, as informações adquiridas com a metagenômica, associada com as informações já existentes de PGPBs, poderão trazer mais resultados positivos de associações bacterianas que visam à promoção do crescimento vegetal, bem como o efeito bacteriano antagonista no controle de agentes fitopatogênicos.

The conventional production system adopted for apple crop depends on non-renewable resources, such as fertilizers, in addition to the excessive amount of insecticides. Fortunately, this system is being replaced by an organic system. Plant growth promoting bacteria (PGPB) are bacteria found in soil and roots of host plants. These bacteria also play an important role in biological control, as they can induce systemic resistance against various pathogens. This study had two aims: 1) to evaluate the diversity of cultivable PGPB isolated from rhizospheric soil and roots of apple trees cultivated under different crop systems in the south of Santa Catarina state; and 2) the bioprospection of metagenomic clones able to induce apple systemic resistance against Colletotrichum gloeosporioides, the causal agent of leaf spot disease. For the first objective, samples of roots and rhizospheric soil of apple trees cultivated in organic and conventional orchards were collected, together with soil samples from an area never used for agriculture. Bacteria were identified at the genus level by PCR-RFLP 16S rRNA gene analysis and partial sequencing methodologies and were evaluated for several plant growth abilities. Among the 300 strains isolated, 214 were able to produce siderophores, 34 were able to solubilize phosphates and 21 isolates produced a large amount of indolic compounds. Seventy-nine isolates presented some antagonist activity against C. gloeosporioides. Among the most abundant genera identified were, respectively, Rahnella sp., Enterobacter sp., Pseudomonas sp., Stenotrophomonas sp., Rhizobium sp., Pantoea sp., and Raoultella sp. An in vivo experiment was conducted with five isolates and C. gloesporoides fungus, it was observed that the isolate 89, identified as Burkholderia sp., was able to reduce the phytopathogenic damage in the inoculated plants. Our results allowed us to infer how anthropogenic activity is affecting the bacterial communities in soil associated with apple tree crop systems, and to obtain an isolate that was able to delay the emergence of an important disease for this culture. In relation to the second objective, samples of rhizospheric soil from apple trees cropped in organic and conventional orchards in São Joaquim locality (SC) were collected and metagenomic DNA was extracted. To construct metagenomic libraries, the CopyControlTM HTP Fosmid Library Production (EPICENTRE) kit was used. Up to know 160 clones were tested in relation their antagonistic ability against C. gloeosporioides fungus in in vitro assays. However, none of them was able to inhibit the fungal growth. With the advent of metagenomics, non-cultivable micro-organisms in the soil may have their DNA and / or part unraveled, and thus obtain an immeasurable range of biomolecules for use in biotechnological purposes in apple orchards. Thus, the information acquired with metagenomics, associated with existing information PGPBs may bring more positive results of bacterial associations seeking to promote plant growth and bacterial antagonist effect in controlling pathogenic agents.