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Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina

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Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina

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Título Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina
Autor Souza, Larissa Milano de
Orientador Saffi, Jenifer
Co-orientador Lenz, Guido
Data 2014
Nível Mestrado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Doxorrubicina
Fibroblastos
Reparação do DNA
Resumo Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência.
Abstract Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.
Tipo Dissertação
URI http://hdl.handle.net/10183/104790
Arquivos Descrição Formato
000940324.pdf (2.589Mb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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