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Tumor de Walker 256 : um estudo sobre características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases

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Tumor de Walker 256 : um estudo sobre características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases

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Título Tumor de Walker 256 : um estudo sobre características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases
Autor Buffon, Andreia
Orientador Sarkis, João José Freitas
Data 2006
Nível Doutorado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica.
Assunto Carcinoma 256 de Walker
Ectonucleotidases
Resumo Nucleotídeos da adenina e adenosina estão envolvidos em uma variedade de processos patofisiológicos em diferentes células. O metabolismo extracelular destes nucleotídeos gerando nucleosídeos tem uma importante função regulatória no controle da homeostase, principalmente por regularem a agregação plaquetária, via receptores purinérgicos P2. Além disso, uma associação destes nucletídeos e nucleosídeo em processos neoplásicos tem sido sugerida. Enquanto ATP tem demonstrado exibir atividade anticâncer em uma grande variedade de células animais e humanas, estudos sugerem que adenosina possui ações promotoras de tumor. Muitos estudos também demonstram que antiinflamatórios não esteroidais, como o ácido acetil salicílico (AAS), podem proteger contra o desenvolvimento do câncer. As ações induzidas pela sinalização purinérgica são reguladas pelas ectonucleotidases, que incluem membros da família das ectonucleosídeo trifosfato difosfoidrolase (E-NTPDase) e ecto-nucleotídeo pirofosfatases/fosfodiesterases (E-NPPs), e ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Assim, no presente estudo nós investigamos o efeito do AAS na hidrólise do ATP até adenosina, bem como estudamos as características bioquímicas e expressão das ectonucleotidases no tumor de W256. A hidrólise dos nucleotídeos da adenina por plaquetas de ratos foi significativamente inibida por AAS, tanto para ATP quanto para ADP, mas não houve alteração na hidrólise do AMP. Em ratos submetidos ao tumor de W256, a hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro, obtidos 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea do tumor, foi significativamente reduzida. Em células tumorais de W256 (forma ascítica do tumor), a análise cinética indicou que várias ectonucleotidases estão envolvidas nessa cascata enzimática. Quanto às propriedades bioquímicas das E-NTPDases e ecto-5'-nucleotidase, para a hidrólise de ATP, ADP e AMP, o pH ótimo ficou entre 6,5-8,0 e também foi observado um requerimento de cátions divalentes (Mg2+ > Ca2+). Uma significativa inibição na hidrólise do ATP e ADP foi observada em presença de altas concentrações de azida sódica e de 0,5 mM de cloreto de gadolínio. Ainda, a análise de mRNA por PCR identificou a presença das NTPDases 2 e 5, e também da ecto-5'-nucleotidase nas células tumorais de W256. Com o objetivo de investigar as enzimas envolvidas no catabolismo dos nucleotídeos da adenina durante o crescimento do tumor, nós avaliamos a expressão destas enzimas bem como o padrão de degradação dos nucleotídeos extracelulares no tumor de W256, 6, 10 e 15 dias após a indução subcutânea. Os mRNAs de todas as ectonucleotidases estudadas (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 e ecto- 5’-nucleotidase), foram identificados por RT-PCR. A análise quantitativa, realizada por real-time PCR, apresentou como genes dominantes expressos durante o crescimento do tumor, as NTPDases 1 e 2 e ecto-5’-nucleotidase. O padrão de hidrólise do ATP extracelular determinado por HPLC, embora com alguma diferença entre os tempos estudados, se manteve similar. As células do tumor de W256 rapidamente hidrolisaram ATP levando à formação transitória de ADP, que foi completamente hidrolisado a AMP. A participação das NPPS 1, 2 e 3 na forma ascítica do tumor e VI durante o desenvolvimento do tumor subcutâneo de W256 também foi investigada. Nas duas formas do tumor o gene dominante foi o da enzima NPP3. Considerando que o ATP é reconhecido como um composto citotóxico em células tumorais, e que adenosina tem sido considerada promotora de tumor, é possível sugerir que, na circulação, a substancial redução na hidrólise dos nucleotídeos da adenina em plaquetas e soro após a indução do tumor pode representar um mecanismo de proteção contra o desenvolvimento tumoral. Por outro lado, nas células tumorais de W256, a elevada expressão de enzimas potencialmente envolvidas na hidrólise do ATP e do AMP, bem como a rápida hidrólise do ATP, pode representar um mecanismo que facilita a proliferação e invasão do tumor.
Abstract Adenine and adenosine nucleotides are involved in a variety of pathophysiological process in different cells. The extracellular metabolism of these nucleotides creating nucleosides has an important regulatory function in controlling the homeostasis, mainly for regulate the platelets aggregation, via purinergic P2 receptors. Besides this, an association of these nucleotides and nucleoside in neoplasics process has been suggested. While ATP has shown to exhibit anticancer activity in a great variety of animals and human cells, studies suggest that adenosine presents tumor-promoting actions. Many studies have also demonstrated that nonsteroidal anti-inflamatory, such as acetylsalicylic acid (ASA) can protect against the cancer development. The induced actions from purinergic signalization are ruled by the ectonucleotidases, that include members of the ectonucleoside triphosphate diphosphohydrolases (E-NTPDases) and ecto-nucleotide pyrophosphatases/phosphodiesterases (E-NPPs) families, and ecto-5’-nucleotidase (ecto-5’N). Then, in the present study we have investigated the effect of the ASA on the ATP hydrolysis to adenosine, such as studied the biochemical characteristics and expression of the ectonucleotidases in W256 tumor. The hydrolysis of the adenine nucleotides by rat platelets was significantly inhibited by ASA, both for ATP and ADP, but there was no alteration on AMP hydrolysis. In rats submitted to W256 tumor, hydrolysis of the adenine nucleotides by platelets and serum, obtained 6, 10 and 15 days after tumor’s subcutaneous induction, was significantly reduced. In W256 tumor cells (ascitic form of tumor), the kinetic analysis indicated that various ectonucleotidases are involved in this enzymatic cascade. Regarding the biochemistry properties of E-NTPDases and ecto-5'-nucleotidase, for the ATP, ADP e AMP hydrolysis, the optimum pH was reached among 6,5-8,0 and it was also observed a requirement of divalent cations (Mg2+ > Ca2+). A significant inhibition on ATP and ADP hydrolysis was observed in the presence of high concentrations of sodium azide and 0.5 mM of gadolinium chloride. Also, the mRNA by PCR analysis identified the presence of NTPDases 2 and 5, and also the ecto-5'-nucleotidase in W256 tumor cells. With the purpose of investigating the enzymes involved in the catabolism of adenine nucleotides during the tumor’s growth, we evaluated the expression of these enzymes as well as the pattern degradation of extracellular nucleotides in W256 tumor, 6, 10 and 15 days after the tumor’s subcutaneous induction. The mRNAs of all ectonucleotidases studied (NTPDase 1, 2, 3 5 e 6 and ecto-5’-nucleotidase) were identified by RT-PCR. The quantitative analysis, done by real-time PCR, presented as dominant genes expressed during the tumor’s growth, the NTPDases 1 and 2 and ecto-5’-nucleotidase. The pattern of ATP extracellular hydrolysis determined by HPLC, despite a small difference between the times studied, kept similar. The W256 tumor’s cells quickly hydrolyzed ATP, leading to the transitory formation of ADP, which was completely hydrolyzed to AMP. Considering that ATP is recognized as a citotoxic compound in tumor cells, and that adenosine has been considered tumor’s promoter, it is possible to suggest that, in the circulation, the substantial VIII reduction on adenine nucleotides hydrolysis in platelets and serum after tumor’s induction may represent a mechanism of protection against the tumor’s development. The participation of NPPs 1, 2 and 3 in the ascitic form of tumor and during the subcutaneous W256 tumor’s growth was also investigated. In the two forms of the tumor, the dominant gene expressed was the NPP3 enzyme. On the other hand, in W256 tumor cells, the high expression of enzymes potentially involved in ATP and ADP hydrolysis, as well as the fast ATP hydrolysis, may represent a mechanism that facilitate the proliferation and invasion of tumor.
Tipo Tese
URI http://hdl.handle.net/10183/10533
Arquivos Descrição Formato
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