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Padronização de método de imunodetecção em células SH-SY5Y diferenciadas para avaliação da atividade de fosfatase homóloga a tensina (PTEN)

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Padronização de método de imunodetecção em células SH-SY5Y diferenciadas para avaliação da atividade de fosfatase homóloga a tensina (PTEN)

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Título Padronização de método de imunodetecção em células SH-SY5Y diferenciadas para avaliação da atividade de fosfatase homóloga a tensina (PTEN)
Autor Paz, André Vinícius Contri
Orientador Gama, Clarissa Severino
Co-orientador Aguiar, Bianca Wollenhaupt de
Data 2014
Nível Graduação
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Curso de Biomedicina.
Assunto Ácido valpróico
Fosfatases
Neuroblastoma
Transtorno bipolar
Western blotting
Resumo A fosfatase homóloga à tensina (PTEN) é uma proteína fundamental na regulação de vários processos celulares no sistema nervoso central, tais como plasticidade, formação de sinapses e sobrevivência neuronal. Dentre as vias controladas por ela, destaca-se a via da PI3K/Akt que está altamente relacionada aos transtornos de humor, em especial o Transtorno de Humor Bipolar (THB). O valproato (VPA), um dos principais fármacos utilizados no tratamento do THB, é capaz de modular sua atividade, porém os mecanismos responsáveis permanecem desconhecidos. Com isso, estudar o mecanismo de ação do VPA pode ser de grande importância clínica, podendo fornecer novos alvos farmacológicos para o tratamento do THB. O objetivo principal deste trabalho é padronizar uma técnica de imunodetecção para avaliar a atividade da PTEN em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciadas em neurônios dopaminérgicos, com o objetivo secundário de avaliar se o VPA é capaz de modular sua atividade. As células da linhagem SH-SY5Y foram diferenciadas em neurônios dopaminérgicos com 10 μM de ácido retinóico durante 7 dias e utilizadas na padronização da técnica de Western blot. A padronização incluiu tempo de eletroforese, tempo de transferência, tempo de bloqueio da membrana, concentração de anticorpos primários anti-β-actina, anti-PTEN e anti-fosfo-PTEN, concentração de anticorpo secundário e tempo de exposição em filmes de raio-X. Também foi realizada uma curva de dose-resposta do VPA em células SH-SY5Y diferenciadas com as doses de 50, 80, 100, 120, 300 e 1000 μg/mL por 24 horas, sendo avaliada a viabilidade celular pela técnica de MTT. Após a dose ideal ser definida, foi realizado Western blot da PTEN para ver os efeitos do VPA sobre sua atividade, inferida pela razão entre PTEN total e PTEN fosforilada. A técnica de Western blot foi padronizada com sucesso, sendo possível identificar PTEN total, fosforilada e β-actina nas diluições de anticorpo primário de 1:1000, 1:10000 e 1:20000, respectivamente. O anticorpo secundário foi padronizado na diluição de 1:20000. A curva de dose-resposta do VPA mostrou que a dose de 100 μg/mL seria a mais adequada, uma vez que além de não reduzir a viabilidade celular, encontra-se na faixa terapêutica para o tratamento de episódios maníacos do THB. O VPA foi capaz de induzir a inibição da atividade da PTEN (p=0,043). Este achado é de grande importância, pois o mecanismo pelo qual o VPA modula a atividade da via PI3K/Akt pode ser explicado através da inibição da PTEN. Além disso, a PTEN pode ser um novo alvo farmacológico para o tratamento do THB.
Tipo Trabalho de conclusão de graduação
URI http://hdl.handle.net/10183/109690
Arquivos Descrição Formato
000950409.pdf (592.1Kb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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