Análise de domínios diferenciais em proteínas de superfície ortólogas de Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae e Mycoplasma flocculare são duas espécies geneticamente muito similares. M. hyopneumoniae é o agente etiológico da pneumonia enzoótica suína, enquanto M. flocculare é amplamente distribuído em rebanhos suínos, mas nenhuma doença decorrente da sua presença é observada. O repertório de proteínas ortólogas compartilhadas entre estas duas espécies é de 70% e de proteínas de superfície chega em torno de 90%. Diferenças estruturais e funcionais entre as proteínas ortólogas poderiam explicar, pelo menos em parte, o caráter de patogenicidade ou não destas espécies. A fim de identificar domínios diferenciais, foi realizada uma análise comparativa in silico das proteínas de superfície ortólogas de M. hyopneumoniae e M. flocculare. Foram analisados 184 pares de proteínas ortólogas e foram identificados domínios diferenciais em 85% deles. As sequências codificadoras das regiões diferenciais do par de proteínas hipotéticas ortólogas MHP7448_0612, de M. hyopneumoniae, e MF_00357, de M. flocculare, foram clonadas em vetor de expressão pGEX-4T-3 e expressas em Escherichia coli para a produção dos polipeptídeos recombinantes correspondentes (rMHP61267-169 e rMF35767-197, respectivamente). A resposta imune humoral e celular de camundongos foi analisada para avaliação das possíveis propriedades imunológicas diferenciais de domínios correspondentes de M. hyopneumoniae e de M. flocculare. Ambos os polipeptídeos recombinantes induziram altos níveis de IgG a partir do dia 30 pós-imunização em relação ao grupo controle, mas não houve diferença significativa entre os níveis de IgG entre os animais imunizados com os polipeptídeos recombinantes. Na avaliação da resposta celular, rMHP61267-169 induziu níveis significativamente maiores de IFN-γ e IL-10 em esplenócitos de camundongos não imunizados em relação aos níveis induzidos por rMF35767-197 ou aos observados no controle sem estímulo. Os domínios diferenciais induziram respostas imunes celulares diferenciais em camundongos. Esses resultados apontam um possível envolvimento de domínios diferenciais na resposta imune do hospedeiro contra M. hyopneumoniae e no desenvolvimento da doença.

M. hyopneumoniae and M. flocculare are two genetically similar bacterial species. M. hyopneumoniae is the etiological agent of porcine enzootic pneumonia, while M. flocculare is also widespread in swine herds, although no disease has been associated with its presence. The repertoire of orthologous proteins between M. hyopneumoniae and M. flocculare are 70% of total CDS and 90% of surface proteins. Functional and structural differences between orthologous surface proteins could explain the pathogenicity or non-pathogenicity of these species. To identify differential domains between pairs of orthologous, a comparative in silico analysis of orthologous surface proteins between these two species was performed. A total of 184 ortholog pairs were analyzed and differential domains were found in 85% of them. The coding sequences of differential domains from the pair of ortholog hypothetical proteins MHP7448_0612, from M. hyopneumoniae, and MF_00357, from M. flocculare, were cloned into pGEX-4T-3 and expressed in E. coli for the production of the correspondent recombinant polypeptides (rMHP61267-169 and rMF35767-197, respectively). The humoral and cellular immune response from mice were assessed to evaluate the possible differential immunological properties of corresponding domains from M. hyopneumoniae and M. flocculare. Both recombinant polypeptides induced high levels of IgG starting at 30 post-imunization in comparison to the control group, but no significant difference was observed between IgG levels from mice immunized with the recombinant polypeptides. Regarding cellular immune responses, rMHP61267-169 induced high levels of IFN-γ e IL-10 in splenocytes from non-immunized mice, in comparison to the levels observed in animals immunized with rMF35767-197 or in the non-stimulated control group. Differential domains induced differential cellular immune response in mice. This results suggest a possible involvement of differential domains in host immune response against M. hyopneumoniae and in disease development.