Caracterização de proteoformas expressas no estágio larval do parasito Echinococcus granulosus

Abstract

O termo proteoformas refere-se a todas as formas moleculares na qual variantes proteicas codificadas por um único gene podem ser encontradas, incluindo mudanças devido a variação genética, splicing alternativo e modificações cotraducionais e póstraducionais (MCTs e MPTs, respectivamente). Em Echinococcus granulosus, o agente causador da hidatidose cística, a caracterização de proteoformas ainda não foi sistematicamente abordada e pode revelar mecanimos moleculares relevantes para o estabelecimento do parasito nos hospedeiros intermediários. A caracterização tanto de proteoformas da frutose-bifosfato-aldolase (FBA) e enolase, potencialmente moonlighting, como de outras proteoformas expressas em frações subcelulares do estágio larval deste parasito foi realizada. Em relação às enzimas glicolíticas, várias evidências indicam a EgFBA1 e a EgEno1 como sendo proteínas moonlighting: (i) as localizações não usuais destas proteínas no tegumento de protoescólices e em produtos de excreção/secreção (ES) in vivo (líquido hidático) e in vitro; (ii) características estruturais destas proteínas, com destaque para a identificação de um sítio de ligação à F-actina na estrutura da EgFBA1; (iii) a habilidade destas proteínas de interagirem com várias proteínas não relacionadas à glicólise. Em relação ao repertório de proteínas expressas em frações subcelulares, frações nucleares e citosólicas de protoescólices de E. granulosus foram analisadas através de proteômica top down e bottom up. De modo geral, 525 proteínas foram identificadas, sendo 224 e 156 proteínas exclusivamente detectadas em frações nucleares e citosólicas, respectivamente. Além da identificação de proteínas, nossa abordagem de proteômica top down também permitiu a caracterização de MCTs e MPTs, destacando a excisão da metionina N-terminal e a acetilação N-terminal como modificações conservadas nas proteínas de E. granulosus. Nossos resultados representam as primeiras evidências de funções alternativas realizadas por enzimas glicolíticas em E. granulosus e sugerem que proteínas multifuncionais devem desempenhar papéis importantes na interação parasitohospedeiro. Os proteomas nuclear e citosólico de protoescólices também foram descritos, revelando novos aspectos da biologia do parasito, incluindo proteoformas com MCTs e MPTs, as quais devem desempenhar papéis críticos na regulação de processos celulares deste parasito.

The term proteoforms refers to all molecular forms in which the protein product of a single gene can be found, including changes due to genetic variation, alternatively spliced RNA transcripts and co-translational and post-translational modifications (CTMs and PTMs, respectively). In Echinococcus granulosus, the causative agent of hydatid disease, the characterization of proteoforms has never been systematically addressed and it may reveal molecular mechanisms underlying the parasite biology. Here, the characterization of fructose-bisphosphate aldolase (FBA) and enolase proteoforms, potentially moonlighting, and also, the identification and characterization of proteoforms expressed in subcellular fractions of E. granulosus larval stage were performed. In relation to the glycolytic enzymes, several evidences indicate EgFBA1 and EgEno1 as moonlighting proteins: (i) their unusual locations in protoscolex tegument and in in vivo (hydatid fluid) and in vitro excretory/secretory (ES) products; (ii) their structural features, highlighting the F-actin binding site in the EgFBA1 structure; (iii) their ability to interact with several proteins non-related to glycolysis. In relation to the repertoire of proteins expressed in subcellular fractions, nuclear and cytosolic fractions from E. granulosus protoscoleces were analyzed by top down and bottom up proteomics for protein identification and characterization. Altogether, 525 proteins were identified, with 224 and 156 proteins exclusively detected in nuclear and cytoplasmic fractions, respectively. Besides protein identification, our top down approach also provided CTMs and PTMs characterization, highlighting N-terminal methionine excision and N-terminal acetylation as conserved modifications in E. granulosus proteins. Overall, our results provided the first experimental evidences of alternative functions performed by glycolytic enzymes in E. granulosus and suggested that multifunctional proteins might play important roles in hostparasite interplay. We also provided the description of nuclear and cytosolic proteomes which revealed new aspects of parasite biology, highlighting proteoforms with CTMs and PTMS which might be playing critical roles in regulating cellular processes occurring in this parasite species.