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Expressão da urease ubíqua de soja em Escherichia coli

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Expressão da urease ubíqua de soja em Escherichia coli

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Título Expressão da urease ubíqua de soja em Escherichia coli
Autor Martinelli, Anne Helene Souza
Orientador Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva
Co-orientador Pasquali, Giancarlo
Data 2007
Nível Mestrado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Escherichia coli
Reação em cadeia da polimerase
Soja
Urease
Resumo Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização.
Abstract Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.
Tipo Dissertação
URI http://hdl.handle.net/10183/12032
Arquivos Descrição Formato
000611091.pdf (807.3Kb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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