Contagem de células somáticas e isolamento bacteriano em leite de ovelhas no Estado do Rio Grande do Sul - Brasil

Abstract

A mastite um dos grandes problemas relacionados com criação de ovinos de leite devido às perdas econômicas decorrentes da redução na produção, gastos com medicamento e perdas de animais. A Contagem de Células Somáticas (CCS) e o isolamento bacteriano são ferramentas diagnósticas indicativas da saúde da glândula mamária que pode ser determinada através de método automatizado e por método manual, através de contagem celular em microscópio, sobre o qual existem discussões quanto à coloração adequada ao leite de ovelhas devido a celularidade diferenciada nesta espécie. Esta tese compreende três estudos que visam realizar o diagnóstico de mastite subclínica em ovelhas leiteiras do Estado Rio Grande do Sul – Brasil em um total de 315 amostras de leite oriundos de casos desta enfermidade em ovelhas de leite. [Capítulo 2] Foram utilizadas 116 amostras com o objetivo de identificar e validar uma metodologia de CCS microscópica adequada à espécie ovina. Assim foram confeccionadas lâminas de esfregaços de 10 μL de leite em 1 cm2, onde foram testados os fixadores de xilol e solução de Carnoy e as colorações de May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wrigth (W) e Panótico (P). Elegeu-se a solução de Carnoy, pois esta permitiu uma melhor fixação do filme lácteo às lâminas de microscopia, e o corante BP, pois permitiu uma boa coloração e visualização das células, bem como a diferenciação dos corpúsculos citoplasmáticos. Os valores de CCS variaram de 2,6x104 a 4,4x106 células.mL-1 e de 1,9x104 a 8,1x106 células.mL-1, respectivamente, pelos métodos automático e microscópico. [Capítulo 3] O objetivo do presente capítulo foi determinar a ocorrência de mastite subclínica em rebanho ovino leiteiro, através do isolamento bacteriano e da CCS. Determinou-se, ainda, a composição (gordura, lactose, proteína e sólidos totais) do leite e a relação entre estes parâmetros e a presença de mastite. Para tanto, coletaram-se 315 amostras de leite, individualizadas por teto, das quais 85 (27%) foram identificadas como mastite subclínica, sendo Staphylococcus coagulase negativos o agente prevalente (64,7%), seguido por Staphylococcus coagulase positivas (19,1%). A CCS variou de 2,5x103 a 9,3x106. Verificou-se CCS significativamente maior (p<0,0001) nas amostras com isolamento bacteriano. Entretanto, o mesmo não foi observado entre os parâmetros de composição. Não foi determinada correlação entre os parâmetros de composição e a CCS. [Capítulo 4] Este capítulo teve como objetivos identificar as espécies de SCN em 32 isolados de casos de mastite subclínica em ovinos, através da técnica de PCR-RFLP e sequenciamento do gene gap, e determinar a suscetibilidade dos isolados frente a nove agentes antimicrobianos, pela técnica de disco difusão em ágar. Foram obtidos quatro perfis no sequenciamento, sendo observada a presença de três espécies de SCN: Staphylococcus epidermidis (59,4%), Staphylococcus chromogenes (34,4%) e Staphylococcus devriesei (6,2%), pela primeira vez descrita na região Sul do país em casos de mastite ovina. Todos os isolados foram suscetíveis a cefalotina, ceftiofur e penicilina+novobiocina. Vinte e um isolados (65,6%) apresentaram resistência a pelo menos um agente antimicrobiano e onze isolados (34,4%) mostraram-se suscetíveis a todos os agentes testados. Quatro isolados (12,5%) apresentaram multirresistência e, entre estes, um isolado da espécie S. epidermidis apresentou resistência à oxacilina, confirmada através da amplificação do gene mecA por PCR. Os estudos permitem concluir que os SCN são os agentes etiológicos mais prevalentes relacionados com mastite subclínica em ovelhas leiteiras e sua presença tem correlação com CCS elevada. A determinação da CCS através de método manual demonstra que esta é uma ferramenta aplicável à espécie ovina. Além de se constituir em problema de sanidade animal, a mastite ovina, tem como consequência perdas econômicas ao produtor, SCN possuem potencial zoonótico, destacando a importância destes micro-organismos na saúde pública, tornando primordial a identificação destes agentes, através de ferramentas genotípicas seguras e confiáveis.

The mastitis is one of the major problems related to breeding of milk sheep due to the economic losses arising from the reduction in production, expenditure on medication and loss of animals. The Somatic Cell Count (SCC) and bacterial isolation are diagnostic tools indicative of mammary gland’s health that can be determined by automated method and manual method, through the counting of cell under a microscope, whereupon there are discussions concerning the appropriated staining to the ewe’s milk due to different cellularity in this species. This thesis comprises three studies that aim to make the diagnosis of subclinical mastitis in dairy sheep in Rio Grande do Sul - Brazil in a total of 315 milk samples originated from cases of this disease in dairy sheep. [Chapter 2] It were used 116 samples to identify and validate a method for microscopic SCC suitable for ovine specie. Therefore, were made glass slides for smear of 10 μL of milk in 1 cm2, where were tested xylol fixers and Carnoy solution and May-Grünwald (MG), Broadhurst- Paley (BP), Wright (W) and Panotic (P) dyes. Carnoy solution was elected, because this one allowed a better fixation of the milk film to the microscope slides, and BP staining as it allowed a good staining and visualization of cells and the differentiation of cytoplasmic corpuscles. The SCC values ranged from 2,6x104 to 4,4x106 cells.mL-1 and 1,9x104 to 8,1x106 cells.mL-1, respectively by automatic and microscopic methods. [Chapter 3] The purpose of this chapter was to determine the occurrence of subclinical mastitis in dairy sheep flock, by bacterial isolation and SCC. It was determined also the composition (fat, lactose, protein and total solids) of milk and the relationship between these parameters and the presence of mastitis. In order to do that, were collected 315 milk samples, individualized by teat, of which 85 (27%) were identified as subclinical mastitis and Staphylococcus coagulase negative (SCN) was the prevalent agent (64.7%), followed by Staphylococcus coagulase positive (SCP) (19. 1%). The SCC ranged from 2,5x103 to 9,3x106. There was significant higher SCC (p <0.0001) in samples with bacterial isolation. However, the same was not observed between the composition parameters. There was no correlation between the composition parameters and SCC. [Chapter 4] This chapter aims to identify the species of CNS in 32 isolated from cases of subclinical mastitis in sheep by PCR-RFLP and sequencing of the gap gene and determine the susceptibility of isolates face to nine antimicrobials, by disk agar diffusion technique. Four profiles were obtained in sequencing, revealing the presence of three species of SCN: Staphylococcus epidermidis (59.4%), Staphylococcus chromogenes (34.4%) and Staphylococcus devriesei (6.2%), first described in the south region of the country in cases of sheep mastitis. All isolates were susceptible to cephalothin, ceftiofur and penicillin + novobiocin. Twenty-one isolates (65.6%) showed resistance to at least one antimicrobial agent and eleven isolates (34.4%) were susceptible to all tested agents. Four isolates (12.5%) had multidrug resistance and, among these, an isolated of S. epidermidis was resistant to oxacillin, confirmed by amplifying the mecA gene by PCR. The studies support the conclusion that the SCN are the most prevalent etiologic agents related to subclinical mastitis in dairy sheep and their presence correlates with high SCC. The determination of SCC through manual method demonstrates that this tool is applicable to the ovine species. Besides being an animal health problem, the sheep mastitis results in a economic losses to producers, SCN have zoonotic potential, highlighting the importance of these microorganisms in public health, making it crucial to identify these agents through secure and reliable genotypic tools.