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Desenho e obtenção de genes sintéticos para a expressão heteróloga do fator de reprogramação celular Oct-4 fusionados a transportana 10 em diferentes linhagens de Escherichia coli

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Desenho e obtenção de genes sintéticos para a expressão heteróloga do fator de reprogramação celular Oct-4 fusionados a transportana 10 em diferentes linhagens de Escherichia coli

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Título Desenho e obtenção de genes sintéticos para a expressão heteróloga do fator de reprogramação celular Oct-4 fusionados a transportana 10 em diferentes linhagens de Escherichia coli
Autor Ayres, Raquel M.
Orientador Bonatto, Diego
Data 2014
Nível Mestrado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Células-tronco
Escherichia coli
Resumo As células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) são as células reprogramadas com fatores de transcrição, como Oct-4, Sox-2, Klf-4 e c-MYC (OSKM). As iPSCs são geralmente obtidas pela expressão ectópica de vetores retrovirais e lentivirais contendo os fatores transcricionais OSKM. No entanto, a utilização de sistemas de expressão virais pode levar a mutagênese de inserção e geração de células tumorais. Assim, é preferível que a reprogramação celular ocorra temporariamente por meio de fatores OSKM fusionados com sequências de peptideos para a transdução de proteínas. Neste sentido, os genes sintéticos codificadores de transdução de péptidos fusionados ao N ou C-terminal de OSKM pode ser obtido por ferramentas da bioinformática específicos e sintetizados utilizando técnicas químicas avançadas. Esses genes sintéticos podem ser aplicados para a síntese de proteínas utilizando tanto técnicas in vivo quanto in vitro. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar fatores OSKM fusionados a transportana (TP10) usando genes sintéticos e sistema de transcrição e de tradução in vivo. Além disso, três genes sintéticos adicionais também foram obtidos para expressão de Oct-4 contendo TP10 fusionado na região N-terminal (N-OCT4-TP10), C-terminal (C-OCT4-TP10), e sem TP10 (Oct-4). A expressão ectópica dos três genes sintéticos para Oct-4 foram testadas in vivo em duas diferentes linhagens comerciais de E. coli que expressam a enzima de T7 RNA polimerase. Os dados de Western blot indicaram que todos os genes sintéticos de Oct-4 foram capazes de produzir proteínas recombinantes. No entanto, a expressão mais elevada foi obtida com a construção N-OCT4-TP10. Além disso, as proteínas do fator de transcrição Oct-4 obtitdas foram avaliadas quanto a sua capacidade de ligação a sua respectiva seqüência-alvo de DNA sendo avaliada por meio dos extratos brutos das proteínas de E. coli contendo ou não Oct-4 proteínas ectópica. Os dados do ensaio de ligação demonstraram que todas as sequências de Oct-4 foram capazes de se ligar às suas sequências de reconhecimento. Em conclusão, as proteínas Oct-4 funcionais fusionadas com o peptideo o transdutor pode ser obtido a partir de genes sintéticos, permitindo potencialmente elaborar protocolos de reprogramação virais livres.
Abstract Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed cells with a transcription factors such as Oct-4, Sox-2, Klf-4, and c-MYC (OSKM). iPSCs are generally obtained by ectopic expression of retroviral and lentiviral vectors containing tOSKM. However, the use of viral expression systems can lead to insertional mutagenesis and generation of tumor cells. Thus, it is preferable to temporarily reprogram cell by means of OSKM factors fused to peptides sequences for protein transduction. In this sense, synthetic genes coding to transduction peptides fused to the N- or C-termini of OSKM can be designed by specific bioinformatics tools and synthesized using advanced chemical techniques. Those synthetic genes can be applied for protein synthesis using both in vivo and in vitro techniques. Thus, the objective of this work was to generate OSKM factors fused to transportan (TP10) using synthetic genes and in vivo transcription and translation systems. Moreover, three additional synthetic genes also were obtained for Oct-4 expression containing TP10 fused to: (i) N-terminus (N-OCT4-TP10), e, (ii) C-terminus (C-OCT4-TP10), and (iii) without TP10 (Oct-4). Ectopic expression of the three synthetic genes for Oct-4 was tested in vivo in two different commercial strains of E. coli expressing the enzyme T7 RNA polymerase. Western blot data indicated that the all Oct-4 synthetic genes were able to produce the recombinant protein. However, highest expression was obtained with the construction N-OCT4-TP10. Furthermore, the binding capacity of Oct-4 fusion proteins in these respective target DNA sequences was assessed by the evaluation of E. coli protein extracts containing or not ectopic Oct-4 fusion proteins. Data from binding assay demonstrated that all Oct-4 sequences are able to bind to its recognition sequences. In conclusion, functional Oct-4 proteins fused to transducer peptides can be obtained from synthetic genes, allowing to potentially design viral-free reprogramming protocols.
Tipo Dissertação
URI http://hdl.handle.net/10183/129475
Arquivos Descrição Formato
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