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Purificação e caracterização das lectinas ACL-I e ACL-II da esponja marinha axinella corrugata, imunolocalização da ACL-I e avaliação do seu potencial como marcador de transformação celular

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Purificação e caracterização das lectinas ACL-I e ACL-II da esponja marinha axinella corrugata, imunolocalização da ACL-I e avaliação do seu potencial como marcador de transformação celular

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Título Purificação e caracterização das lectinas ACL-I e ACL-II da esponja marinha axinella corrugata, imunolocalização da ACL-I e avaliação do seu potencial como marcador de transformação celular
Outro título Purification and characterization of lectins ACL-I and ACL-II from the marine sponge Axinella corrugata, immunolocalization of ACL-I and its evaluation as marker of cellular transformation
Autor Dresch, Roger Remy
Orientador Henriques, Amelia Teresinha
Data 2008
Nível Doutorado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
Assunto Axinella corrugata
Citotoxicidade
Esponjas marinhas
Imunohistoquímica
Lectinas
Mitogenicidade
Quimiotaxia
[en] Axinella corrugata
[en] Chemotaxis
[en] Citotoxicity
[en] Immunohistochemistry
[en] Lectins
[en] Marine sponge
[en] Mitogenicity
[en] Transformed cells
Resumo A partir de extratos aquosos da esponja marinha Axinella corrugata, coletada na costa sul do Brasil (Santa Catarina), foram purificadas duas lectinas, ACL-I e ACL-II, por cromatografia em coluna de afinidade de matriz de estroma de coelhopoliacrilamida, seguida por gel filtração em Ultrogel AcA 44. Os trabalhos se concentraram, especialmente, no estudo da lectina com maior atividade hemaglutinante, ACL-I. Dentre os eritrócitos testados, ACL-I aglutinou, fortemente, eritrócitos de coelho, além de eritrócitos caprinos e caninos. A atividade hemaglutinante foi inibida por N-acetil-D-glicosamina, N-acetil-D-galactosamina e Nacetil- D-manosamina com igual intensidade, além de N, N’, N”-triacetilquitotriose, o melhor inibidor. Por outro lado, ACL-II aglutinou, preferencialmente, eritrócitos de coelho e caninos, tendo sua atividade hemaglutinante inibida por N-acetil-Dglicosamina, N-acetil-D-manosamina, quitina, N, N’, N”-triacetilquitotriose e fetuína, além de D-galactose, mas não por N-acetil-D-galactosamina. Ambas lectinas foram fracamente inibidas por N-acetil-D-lactosamina. A atividade hemaglutinante mostrouse independente de cátions divalentes e foi estável a uma ampla faixa de temperatura e de pH para ACL-I e para ACL-II. ACL-I foi estável frente à ação de enzimas proteolíticas, mas perdeu 50 % de sua atividade na presença de agentes redutores e desnaturantes. ACL-I é uma glicoproteína e sua massa molecular relativa foi estimada em 82.300 por SDS-PAGE em condições redutoras e não redutoras, e sem desnaturação pelo calor. Ainda, mostrou ser constituída por 6 subunidades monoméricas de 13.900, apresentando pontes de dissulfeto entre as mesmas. Por FPLC, a massa molecular estimada foi de 78.500. Da mesma forma como para ACL-I, ACL-II apresentou apenas uma banda em sistema SDS-PAGE, na ausência de agente redutor e sem desnaturação pelo calor, cuja massa molecular relativa foi estimada em 80.000, enquanto que por FPLC foi estimada em 78.000. O pI de ACL-I foi de 6,3, avaliado por focalização isoelétrica, e a sua composição centesimal de aminoácidos exibiu uma prevalência de glicina, seguida de ácido aspártico/asparagina, ácido glutâmico/glutamina e alanina. Dentre as atividades biológicas testadas, a ACL-I demonstrou atividade quimiotáxica, mitogênica e citotóxica, mas não antioxidante. Os ensaios imuno-histoquímicos mostraram que ACL-I se encontra intracelularmente em grânulos celulares, provavelmente no interior de células esferulosas da esponja marinha. A lectina também mostrou ser uma ferramenta útil na marcação de células transformadas de mama, cólon, pulmão, ovário e bexiga.
Abstract Two lectins, ACL-I and ACL-II, were purified from aqueous extracts of marine sponge Axinella corrugata, collected at Atlantic coastline of southern Brazil (Santa Catarina) by rabbit stroma-polyacrylamide gel affinity column, followed by size-exclusion chromatography on Ultrogel AcA 44. The analysis were performed, especially, on the study of lectin with greater hemagglutinating activity, ACL-I. Among the erythrocytes tested, ACL-I agglutinated, strongly, native rabbit, goat and dog erythrocytes, whose hemagglutinating activity was inhibited by N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl-Dmannosamine, N-acetyl-D-galactosamine and N, N’, N”- triacetylchitotriose. On the other hand, ACL-II agglutinated, preferentially, rabbit and dog erythrocytes, with its hemagglutinating activity inhibited by D-galactose, N-acetyl-D-glucosamine, N-acetyl- D-mannosamine, chitin, N, N’, N”- triacetylchitotriose and fetuin, but not by N-acetyl- D-galactosamine. Both lectins were weakly inhibited by N-acetyl-D-lactosamine. The hemagglutinating activity was independent of divalent cations and it was stable at large range of temperature and pH to ACL-I and ACL-II. ACL-I was resistent to enzymatic proteolysis, but lost 50 % of its activity in the presence of reducing or denaturant agents. This lectin presented a relative molecular mass of 82,300 estimated by SDS-PAGE in the presence or absence of 2-mercaptoethanol, without pre-heating, and it is constituted by six monomeric subunits of 13,900, showing disulphide bridges among them. By FPLC the relative molecular mass was 78,500. Similar to ACL-I, ACL-II showed one unique protein band by SDS-PAGE, in the absence of 2-mercaptoethanol and without pre-heating, whose relative molecular mass was estimated as 80,000 and by gel filtration as 78,000. The isoelectric focusing of ACL-I revealed the presence of one unique protein band with pI of 6.3 and the amino acid composition showed a prevalence of glycine, followed by aspartic acid/asparagine, glutamic acid/glutamine and alanine. Among the biological activities analysed, the ACL-I demonstrated chemotactic, mitogenic and cytotoxic activities, but not antioxidant. The immunohistochemical assays revealed that ACL-I is stored in vesicles, probably inside of spherulous cells of the marine sponge. The lectin showed to be a useful tool in the labelling of transformed cells of breast, colon, lung, ovary and bladder.
Tipo Tese
URI http://hdl.handle.net/10183/13101
Arquivos Descrição Formato
000634608.pdf (30.95Mb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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