Perfil eletroencefalográfico e de liberação de glutamato e GABA associados à epileptogênese em modelo de acidemia glutárica tipo 1

Abstract

Acidemia glutárica tipo I (AGI) é uma doença metabólica hereditária causada pela mutação no gene que codifica a enzima glutaril-CoA desidrogenase (GCDH). Os principais sintomas aparecem entre os 6 meses e 3 anos de idade e são caracterizados por distonia progressiva, discinesia déficit neurológico, macrocefalia e crises epilépticas recorrentes. Um importante modelo experimental que apresenta características e fenótipo bioquímico muito semelhantes a AGI em humanos é o de camundongos nocaute para a enzima GCDH submetidos à dieta com sobrecarga de lisina (Gcdh -/--Lis). Estudos têm mostrado um desequilíbrio de neurotransmissão excitatória e inibitória no SNC, diminuição da recaptação de glutamato, diminuição da atividade da bomba Na+K+-ATPase, e inibição da enzima descarboxilase do ácido glutâmico (GAD) em modelos animais e em pacientes com AGI. Estas alterações parecem ser causadas pelo acúmulo dos ácidos glutárico, 3-OH-glutárico e glutacônico nos tecidos e fluidos corporais. Neste trabalho avaliamos o desenvolvimento de crises epilépticas espontâneas ou induzidas nos animais Gcdh - /--Lis e a possível associação com mudanças no padrão de liberação de glutamato e GABA no córtex cerebral, Para tanto, analisamos primeiramente o padrão de oscilações cerebrais e a presença de crises epilépticas espontâneas e induzidas por pentilenotetrazol (PTZ) através de técnicas eletrofisiológicas in vivo (vídeo-EEG). Posteriormente avaliamos em sinaptossomas corticais a liberação de glutamato e GABA por HPLC e o imunoconteúdo de vGLUT1, vGAT e GAD utilizando Western blot. A abordagem experimental foi igualmente realizada em animais Gcdh-/- com dieta normal e animais Gcdh+/+ com e sem sobrecarga de lisina (controle). Nossos resultados mostram que 72% dos animais Gcdh-/--Lis (13/18) apresentaram crises epilépticas espontâneas, sem nenhuma manifestação nos animais dos grupos Gcdh- /- (n= 18) ou controle (n=17). Além disso, houve um aumento da severidade das crises epilépticas induzidas com PTZ nos animais Gcdh-/--Lis quando comparados aos grupos Gcdh-/- e controle. Análise espectral do EEG evidenciou uma diminuição significativa das oscilações teta e gama com predomínio de ondas lentas nos animais Gcdh -/--Lis (n=9) quando comparados aos grupos Gcdh -/- (n=5) e controle (n=15). A liberação de glutamato e GABA basais e após despolarização nas preparações de sinaptossoma cortical nos grupos Gcdh -/- e Gcdh -/--Lis foi significativamente menor quando comparada com o grupo controle (p<0,05). Porém, a porcentagem de glutamato liberado após despolarização em relação ao basal aumentou significativamente no grupo Gcdh -/--Lis quando comparado com demais grupos (p<0,05) sem um aumento na porcentagem de liberação de GABA pósdespolarização. Esta diminuição na liberação de GABA foi associada a uma diminuição do imunoconteúdo de GAD em sinaptossomas corticais do grupo Gcdh -/- -Lis. Entretanto o imunoconteúdo dos transportados vesiculares de glutamato (vGLUT1) e GABA (vGAT) foram semelhantes em todos os grupos. Nossos resultados mostram uma hiperexcitabilidade neuronal nos animais Gcdh -/--Lis que pode, pelo menos em parte, estar relacionada com a diminuição nos níveis corticais de GABA pela diminuição da enzima GAD e pelo aumento da liberação de glutamato em relação ao GABA em situações de despolarização neuronal. Observamos também uma mudança no perfil de oscilações corticais que pode estar associada às alterações neurológicas e epileptogênese em AGI. Mecanismos eletrofisiológicos e moleculares envolvidos na epileptogênese dos animais Gcdh-/-- Lis estão em andamento.

Glutaric acidemia type I (GAI) is an inherited metabolic caused by mutations in the gene encoding glutaryl-CoA dehydrogenase (GCDH). Symptoms appear from 6 months to 3 years of age and are characterized by progressive dystonia, dyskinesia, neurological deficit, macrocephaly and recurrent seizures. An important experimental model with features and biochemical phenotype very similar to GAI in humans is the GCDH knockout mice under lysine overload special diet (Gcdh -/--Lis). Studies have shown an imbalance of excitatory and inhibitory neurotransmission in CNS, decreased reuptake of glutamate, and Na + K + ATPase pump activity and glutamic acid decarboxylase (GAD) inhibition in animal models and patients with GAI. These changes appear to be attributed to the increase of glutaric, 3-OH-glutaric and glutaconic acids in tissues and body fluids. In this work, we evaluated the development of spontaneous or induced seizures in Gcdh -/--Lis mice and the possible association with changes in glutamate and GABA release pattern in the cerebral cortex. Therefore, firstly we analyze the brain oscillation profile and the presence of spontaneous epileptic seizures and pentylenetetrazol (PTZ) - induced seizures using in vivo electrophysiology (video - EEG). Subsequently, we evaluated, in cortical synaptosomes, the glutamate and GABA release by HPLC and the VGLUT1, vGAT and GAD immunocontents using Western blot. The same experimental approach was conducted in Gcdh-/- mice under normal diet and Gcdh+/+ mice under either normal diet or under lysine overload (control). Our results show that 72 % of Gcdh -/--Lis mice ( 13/18 ) had spontaneous seizures, while no seizures were observed in Gcdh-/-(n = 18) and control (n = 17) groups. In addition there was an increase in severity of PTZ-induced seizures in Gcdh -/--Lis mice when compared to Gcdh-/- and control groups. EEG spectral analysis showed a significant decrease in theta and gamma oscillations with a predominance of slow waves in Gcdh -/--Lis mice (n = 9) when compared to Gcdh-/- (n = 5) and control (n = 15) groups. The release of glutamate and GABA before and after depolarization was significantly lower in cortical synaptosome preparations from Gcdh -/- and Gcdh -/--Lis mice when compared with control group (p<0.05). However, the percentage of glutamate released after depolarization increased significantly in Gcdh -/--Lis mice when compared with other groups (p<0.05), with no increase in percentage of GABA release post-depolarization. This reduction in GABA release was associated with a decreased immunocontent of GAD in cortical synaptosomes from Gcdh -/--Lis. However, the immunocontent of vesicular glutamate and GABA transporter (VGLUT1 and vGAT) were similar in all groups. Our results show that Gcdh -/--Lis mice exhibited neuronal hyperexcitability that can be, at least in part, related to reduced levels of GABA in cerebral cortex induced by decreased in the GAD immunocontent and the increased glutamate release during neuronal depolarization. We also observed a change in the cortical oscillation profile that can be associated with neurological abnormalities and epileptogenesis in AGI. Electrophysiological and molecular mechanisms underlying epileptogenesis in Gcdh -/--Lis mice are under investigation.