Citotoxicidade dos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35 em cultura organotípica de hipocampo de ratos

Abstract

A Doença de Alzheimer (DA) é a mais comum desordem neurodegenerativa relacionada à idade. Os sintomas clínicos resultam da deterioração de determinadas regiões cognitivas, particularmente aquelas relacionadas à memória. Estima-se que 29 milhões de pessoas no mundo sofram de demência do tipo DA. A presença de emaranhados neurofibrilares (NFTs) intracelulares constituídos pela proteína tau hiperfosforilada e as placas extracelulares constituídas pela proteína beta-amilóide (Aβ) são características da DA. Existe uma ampla variedade de evidências genéticas, fisiológicas e bioquímicas que suportam a idéia que o peptídeo Aβ é ao menos uma das causas que originam a DA. Em diferentes modelos experimentais têm sido utilizados diversos peptídeos Aβ sintéticos para estudar os mecanismos de toxicidade envolvidos na DA. Entre os fragmentos do peptídeo Aβ utilizados, o peptídeo Aβ25-35 é considerado o mais curto fragmento tóxico exercendo efeitos neurotóxicos similares àqueles produzidos pelos peptídeos Aβ1-40 ou Aβ1-42, tais como danos no aprendizado e na memória, apoptose neuronal, disfunção colinérgica e estresse oxidativo. Este fragmento exibe significantes níveis de agregação molecular, mantendo a toxicidade observada pelo peptídeo Aβ1-42 e dessa forma representa a região biologicamente ativa do peptídeo encontrado em pacientes com DA. Assim, o peptídeo Aβ25-35 é rotineiramente usado para estabelecer modelos de DA, para estudar as propriedades neurotóxicas do peptídeo Aβ e para a triagem de fármacos neuroprotetores. Neste trabalho, nós procuramos estabelecer uma comparação entre os dois peptídeos Aβ comumente usados, Aβ1-42 e Aβ25-35 num modelo in vitro de toxicidade pelo peptídeo Aβ. Para esse propósito foram utilizadas culturas organotípicas de hipocampo de rato expostas a 25 μM do peptídeo Aβ1-42 ou a 25 μM do peptídeo Aβ25-35 durante 48h. A morte celular foi quantificada pela medida da captação do iodeto de propídeo (IP), um marcador de morte celular. Nós observamos que ambos os peptídeos Aβ apresentaram toxicidade similar, causando cerca de 39% de dano celular no hipocampo. Não houve diferença significativa na extensão da morte celular entre os peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35, indicando que ambos causaram um efeito tóxico similar. Além disso, nós avaliamos a ativação de caspase 3, uma proteína executora chave na apoptose, por Western blotting. A exposição a 25 μM dos peptídeos Aβ1-42 ou Aβ25-35 por 48h aumentou significativamente a quantidade de caspase 3 clivada quando comparado às fatias controles não expostas aos peptídeos. Além disso, não houve diferenças entre os níveis de caspase 3 clivada induzida pelos peptídeos Aβ1-42 e Aβ25-35. Nós também não observamos efeito de ambos os peptídeos na fosforilação das proteínas PTEN e Akt; porém, de modo contrário, a percentagem de fosforilação da proteína GSK-3β foi aumentada por ambos os peptídeos Aβ. Neste trabalho, nós também avaliamos o efeito do tratamento prévio das culturas com 25 μM de resveratrol. O tratamento das culturas por 72h com resveratrol antes da exposição ao peptídeo Aβ25-35 parece exercer efeito neuroprotetor. Embora mais estudos sejam necessários para entender os mecanismos da toxicidade do peptídeo Aβ, nossos resultados fornecem fortes evidências de que o peptídeo Aβ1-42 e o fragmento sintético Aβ25-35 induzem dano celular de maneira semelhante.

Alzheimer’s disease (AD) is the most commom age-related neurodegenerative disorder. The clinical symptoms result from deterioration of selective cognitive domains, particularly those related to memory. It is estimated that 29 million people worldwide suffer from dementia like AD. The presence of intracelular neurofibrilary tangles (NFTs) of the hyperphosphorylated protein tau and extracellular amyloid-beta (Aβ) protein into plaques are the hallmarks of AD. There is a plethora of genetic, physiological and biochemical evidences that supports the idea that Aβ is at least one of the originating causes of the AD. Several synthetic Aβ peptides have been used to study the mechanisms of toxicity involved in AD. Among the Aβ fragments studied so far, the Aβ25-35 peptide is considered the shorter toxic fragment exerting neurotoxic effects similar to those produced by Aβ1-40 or Aβ1-42 peptides, such as learning and memory impaired, neuronal apoptosis, cholinergic dysfunction, and oxidative stress. Therefore, this peptide exhibits significant levels of molecular aggregation, retaining the toxicity of the full-length peptide and representing the biologically active region of Aβ1-42 peptide. Thus Aβ25-35 peptide is communly used to establish the AD model for the study of the neurotoxic properties of Aβ peptide and drug screening. In this work, we sought to establish the comparison between two commonly used Aβ peptides Aβ1-42 and Aβ25-35 on an in vitro model of Aβ toxicity. For this purpose, we used organotypic slice cultures of rat hippocampus exposed to 25 μM of both Aβ peptides for 48h. Cell death was quantified by measuring propidium iodide (PI) uptake, a marker of necrotic dead cell. We observed that both Aβ peptides caused about 39% of cell damage in hippocampus. There were no significant cell death differences between Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides, indicating that both caused the similar toxic effect. Moreover, we evaluated the caspase-3 activation, a key executor in apoptosis, by Western blotting. The exposure to 25 μM of Aβ1-42 or Aβ25-35 peptides for 48h significantly increased the amount of cleaved-caspase-3 when compared to control slice cultures not exposed to peptides. Besides, there were no statistical differences between cleaved-caspase-3 induced by Aβ1-42 and Aβ25-35 peptides. In addition, we did not observe any effect of both peptides on PTEN and Akt phosphorylation; otherwise the phosphorylation of GSK-3β was increased by both Aβ peptides. In this work, we also evaluated the effects of treatment with 25 μM of resveratrol on cell death induced by 25 μM of Aβ25-35 peptide. The treatment of cultures for 72h with resveratrol before the Aβ25-35 peptide exposure seems to exert neuroprotective effects. Although further studies are necessary for understanding the mechanisms underlying Aβ peptide toxicity, our results provide strong evidence that Aβ1-42 and the synthetic fragment Aβ25-35 peptides induce neuronal injury in a similar pattern.