Detecção de Chlamydia trachomatis em amostras de urina masculina por reação em cadeia da polimerase

Abstract

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres.

Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.