Química e atividades antioxidante e anticolinesterásica de espécies da família lycopodiaceae

Abstract

A doença de Alzheimer é uma doença neurodegenerativa que causa perdas de memória, danos cognitivos e no comportamento, sendo considerada uma das causas principais de demência entre a população. Esta doença é caracterizada por uma intensa perda neuronal colinérgica, de forma que tanto os inibidores da enzima acetilcolinesterase (AChE) quanto compostos antioxidantes possam ser empregados como neuroprotetores. Nesse sentido, plantas da família Lycopodiaceae vêm sendo estudadas como fonte de novos alcalóides anticolinesterásicos desde a descoberta da huperzina A, isolada a partir da planta chinesa Huperzia serrata. Este trabalho foi realizado com o objetivo de caracterizar e isolar os alcalóides majoritários de Huperzia acerosa, H. heterocarpon, H. quadrifariata, H. reflexa, Lycopodiella cernua, Lycopodium clavatum e L. thyoides, de ocorrência no estado do Rio Grande do Sul, bem como avaliar as atividades anticolinesterásicas e antioxidantes in vitro e in vivo para os extratos. Extratos de alcalóides totais de espécies de L. clavatum e L. thyoides ocorrentes no Brasil e Argentina foram comparados quanto ao seu conteúdo químico, aliado à atividade anticolinesterásica. A atividade inibitória para AChE e butirilcolinesterase (BuChE) dos alcalóides isolados também foi ensaiada, juntamente com a determinação das propriedades citotóxicas exercidas pelos extratos sobre uma linhagem de gliomas C6. Todos os extratos de alcalóides foram analisados através de CG-EM, sendo os perfis de fragmentação dos compostos comparados através de dados da literatura. L. clavatum e L. thyoides possuem perfil químico similar, com licopodina e acetildiidrolicopodina como alcalóides principais, enquanto que L. cernua possui apenas dois alcalóides, cernuína e licocernuína. Os extratos de alcalóides de H. acerosa, H. quadrifariata e H. reflexa também foram analisados, sendo detectados tanto compostos do grupo licopodano quanto do grupo flabelidano, juntamente com outros alcalóides cujas estruturas ainda são desconhecidas. Os alcalóides encontrados em H. heterocarpon não puderam ser elucidados a partir de dados de fragmentação, uma vez que eles não coincidiram com nenhum perfil da literatura. Nesse estudo verificamos que dentre os extratos analisados, H. quadrifariata e H. reflexa promoveram a maior inibição para a enzima AChE obtida de eritrócitos humanos, com IC50 de 2,0 e 0,11 μg/mL, respectivamente, enquanto que H. heterocarpon foi o único extrato com maior seletividade para a BuChE (IC50 = 8,3 μg/mL). Além disso, dentre os alcalóides isolados licopodina, acetildiidrolicopodina, cernuína, licocernuína e clavolonina, apenas acetildiidrolicopodina e cernuína possuem inibição importante, sendo que nenhum deles possui efeito butirilcolinesterásico significativo. Também foi estimada a atividade anticolinesterásica para os extratos de alcalóides totais de L. clavatum e L. thyoides empregando-se homogenatos de córtex, hipocampo e estriato de ratos como fonte enzimática, sendo determinadas suas curvas de inibição com distintos tempos de incubação em uma faixa de concentrações. Também foi verificada para os dois extratos uma inibição do tipo competitiva/não-competitiva, bem como seu perfil antioxidante in vitro pelos métodos de descoloração do radical DPPH, degradação da 2-deoxirribose, TRAP e óxido nítrico. Após um tratamento agudo em camundongos de 14 meses com os extratos, foram verificados os efeitos antioxidantes através do método de TBA-RS, e para as enzimas catalase e superóxido dismutase. Do mesmo modo, verificamos que os mesmos extratos promoveram uma diminuição na atividade da acetilcolinesterase, quando administrados por via intraperitoneal. Nessa metodologia, os extratos mais potentes foram H. quadrifariata e H. reflexa, corroborando o efeito in vitro encontrado para os mesmos. Os extratos purificados de alcalóides de L. clavatum e L. thyoides com habitat no Brasil e Argentina foram comparados quanto ao seu perfil químico e biológico. Nesse estudo, foi verificado que os alcalóides licopodina e acetildiidrolicopodina são os compostos majoritários para todas as espécies, tendo L. clavatum maior atividade anticolinesterásica em relação a L. thyoides, tanto a espécie brasileira quanto a espécie argentina.

Alzheimer’s disease is a neurodegenerative disease which causes memory loss, cognitive and behavioral damages, considered to be the leading cause of dementia among the elderly. This disease is characterized for an intense cholinergic loss, and the use of acetylcholinesterase (AChE) inhibitors together with antioxidant compounds as neurprotectors is a strategy for the treatment. In this sense, Lycopodiaceae plants are well studied as a source of new anticholinesterasic alkaloids since the discovery of huperzine A, isolated from Chinese Huperzia serrata. This work was conducted with the objective of characterize and isolate the main alkaloids from Huperzia acerosa, H. heterocarpon, H. quadrifariata, H. reflexa, Lycopodiella cernua, Lycopodium clavatum and L. thyoides, with occurrence in Rio Grande do Sul state, and also evaluate the anticholinesterasic and antioxidant activities in vitro and in vivo for the extracts. Alkaloidal extracts from L. clavatum and L. thyoides species with habitat in Brazil and Argentina were compared to their chemical content, together with their anticholinesterasic activity. The inhibitory effect for AChE and butyrylcholinesterase (BuChE) for the isolated alkaloids was also evaluated, together with the determination of the cytotoxic properties exherced by the extracts in a gliome C6 cell line. Every alkaloidal extract was analyzed by means of GC-MS, and the fragmentation patterns for the compounds were compared with those from literature. L. clavatum and L. thyoides have similar chemical profile, with lycopodine and acetyldihydrolycopodine as main alkaloids, while L. cernua has only two alkaloids, cernuine and lycocernuine. The alkaloidal extracts of H. acerosa, H. quadrifariata e H. reflexa were also analyzed, and compounds from lycopodane and flabellidane groups were detected, along with other alkaloids whose structures are still unknown. The alkaloids found in H. heterocarpon could not be elucidated with fragmentation dates so far, since they did not coincide with those found in literature. We also verified that among the extracts, H. quadrifariata and H. reflexa promoted a higher inhibition for AChE obtained from human erythrocytes, with a IC50 value of 2,0 e 0,11 μg/mL, respectively, while H. heterocarpon extract was the only more selective for BuChE (IC50 = 8,3 μg/mL). Moreover, among the isolated alkaloid lycopodine, acetyldihydrolycopodine, cernuine, lycocernuine and clavolonine, only acetyldihydrolycopodine and cernuine possess an important inhibition, and none significantly inhibited butyrylcholinesterase. It was also assessed the anticholinesterase effect for the alkaloidal extracts of L. clavatum and L. thyoides employing cortex, hippocampus and striatum rat brain homogenates as enzymatic sources, being determined the incubation time-inhibition curves over a concentrations range. It was also verified for both extracts an inhibitory effect of the competitive/non competitive mixed type, as well as their in vitro antioxidant profile using the methods of DPPH radical decoloration, 2-deoxyrribose degradation, TRAP and nitric oxide. After an acute treatment in 14 months-aged mice, we verified the antioxidant effects though TBA-RS and also the enzymes catalase and superoxide dismutase. In the same way, we found out that the same extracts reduced the acetylcholinesterase activity when administered by intraperitoneal injection. Using this methodology, the most potent extracts were H. quadrifariata and H. reflexa, corroborating the in vitro effect found for them. The purified alkaloidal extracts of L. clavatum and L. thyoides with habitat in Brazil and Argentine were compared to their chemical and biological profile. In this study, we found out that lycopodine and acetyldihydrolycopodine are the main alkaloids found for all species, and L. clavatum possesses a better inhibition against AChE when compared to L. thyoides for both Brazilian and Argentinean collected species.