Caracterização de Salmonella derby originada da cadeia produtiva de suínos: formação de biofilme, resistência a antimicrobianos e perfil de macro-restrição (PFGE)

Abstract

Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Derby (S. Derby) é um dos sorovares mais frequentemente detectados na cadeia produtiva de suínos na região sul do Brasil. Estudos prévios indicaram que isolados de S. Derby apresentando perfis similares de resistência a antimicrobianos estavam circulando ao longo dos anos nesta região. A sobrevivência de Salmonella no ambiente e a persistência no hospedeiro são facilitadas pela sua habilidade em formar biofilmes. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi identificar a presença de grupos clonais entre 140 isolados de S. Derby coletados ao longo de um período de dez anos de diferentes origens da cadeia produtiva de suínos (linfonodos, conteúdo intestinal, ambiente e produtos suínos). Para tanto, o perfil de resistência a antimicrobianos, através de dois conceitos distintos de avaliação de resistência (valores ECOFF e valores de breakpoint), a habilidade em formar biofilmes e a caracterização genotípica por macro-restrição (PFGE) foram avaliados. A determinação do MIC foi realizada em todos os isolados, frente aos seguintes antimicrobianos: ácido nalidíxico, ampicilina, cefotaxima, ceftazidima, ciprofloxacina, colistina, florfenicol, gentamicina, estreptomicina e tetraciclina. Para avaliar a capacidade de S. Derby em formar biofilmes, três metodologias foram aplicadas: i. morfologia de colônia em ágar contendo Vermelho Congo, para determinar a detecção fenotípica de fímbria curli e celulose; ii. formação de biofilme na interface ar-líquido em caldo LB; iii. aderência em microplacas de poliestireno de 96 poços. No total, apenas 17 (12,1%) isolados puderam ser classificados como suscetíveis a todos os antimicrobianos testados. As maiores frequências de populações “non-Wild Type” (nWT) foram observadas frente a tetraciclina (75,7%), estreptomicina (70%) e colistina (11,4%), enquanto que não foram detectadas populações nWT para ciprofloxacina, ceftazidima e gentamicina. Multi-resistência (resistência a ≥ 3 antimicrobianos; de acordo com valores de breakpoint) foi detectada em 8,6% dos isolados. Em ágar contendo Vermelho Congo, três diferentes morfologias de colônia foram observadas. A morfologia Rdar (vermelha, seca e rugosa) foi a mais frequente, sendo detectada em 59 isolados (42,1%); enquanto que as morfologias Saw (branca e mucoide) e Pdar (rosa, seca e rugosa) foram observadas em 46 (32,9%) e em 35 (25%) dos isolados, respectivamente. Os morfotipos Rdar e Pdar, que em conjunto albergaram a maioria dos isolados, são considerados os mais usualmente observados em isolados de Salmonella capazes de formar biofilme. A formação de película rígida, sem dispersão por agitação, foi observada em 24 amostras (17,1%) em caldo LB convencional e em 78 amostras (55,7%) em caldo LB low salt, sendo todas pertencentes aos morfotipos Rdar ou Pdar. Em placas de poliestireno de 96 poços, um grande número (n=96; 68,6%) dos isolados foram fracamente ou moderadamente produtores de biofilme, incluindo todos os isolados que apresentaram os morfotipos Rdar e Pdar. Através dos perfis de formação de biofilme e de resistência a antimicrobianos observados, 36 isolados foram selecionados para macro-restrição por eletroforese em campo pulsado (PFGE). Destas, 27 foram agrupadas em 11 pulsotipos que apresentavam mais de uma cepa com 100% de similaridade. Desta forma, foi possível identificar clones e cepas intimamente relacionadas de S. Derby que circularam em granjas, matadouros-frigoríficos e foram encontrados em alimentos ao longo de uma década.

Salmonella enterica subsp. enterica serovar Derby (S. Derby) is one of the serovars most frequently detected in the swine production chain of southern Brazil. Previous studies indicated that isolates of S. Derby displaying similar antimicrobial resistance profiles circulated over the years in this region. Survival of Salmonella in the environment and persistence in the host are facilitated by the ability to form biofilms. Thus, the aim of this study was to identify the presence of clonal groups between 140 S. Derby isolates collected over a ten-year period from various porcine origins (lymph nodes, intestinal content, environment and pork). Therefore, the antimicrobial resistance profile, through two distinct concepts of resistance evaluation (ECOFF value and breakpoint value), the ability to form biofilm and the genotypic characterization by macro-restriction (PFGE) were evaluated. MIC determinations were performed on all isolates, against the following antimicrobials: nalidixic acid, ampicillin, cefotaxime, ceftazidime, ciprofloxacin, colistin, florfenicol, gentamicin, streptomycin and tetracycline. To evaluate the S. Derby ability to form biofilm, three methods were applied: i. colony morphology on Congo Red agar, to determine the phenotypic detection of curli fimbriae and cellulose; ii. biofilm formation in liquid-air interface of LB broth; iii. adherence on a 96-well polystyrene microtiter plate. In total, only 17 (12.1%) isolates were classified as susceptible to all antimicrobials tested. The highest frequencies of non-Wild Type (nWT) populations were observed against tetracycline (75.7%), streptomycin (70%) and colistin (11.4%), whereas there were no detectable nWT population to ciprofloxacin, ceftazidime and gentamicin. Multidrug resistance (resistance to ≥ 3 antimicrobials) was detected in 8.6% of isolates. On Congo Red agar, three different colony morphology types were observed. The Rdar type (read, dry and rough) was the most frequent, being detected in 59 isolates (42.1%); while Saw (white and smoth) and Pdar (pink, dry and rough) types were observed in 46 (32.9%) and 35 isolates (25%), respectively. The Rdar and Pdar types, which together encompassed the majority of the isolates, are considered the most often observed in Salmonella isolates able to form biofilm. The formation of a rigid pellicle, which could not be dispersed by agitation, was observed in 24 (17.1%) isolates in conventional LB broth and in 78 (55.7%) isolates in low salt LB broth, all belonging to morphotypes Rdar or Pdar. On 96-well polystyrene microtiter plate, a larger number (n=96; 68.6%) of isolates showed to be weak or moderate biofilm producers, including all isolates that showed the Rdar and Pdar type. Through the biofilm and resistance profiles observed, 36 isolates were selected for macro-restriction for pulsed-feld gel electrophoresis (PFGE). Of these, 27 isolates were clustered in 11 pulsotypes which presented more than one strain with 100% of similarity. Therefore, was possible to identify clones and strains closely related of S. Derby that circulated in pig farms, slaughter plants and encountered in foods along a decade.