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Clonagem e expressão de provável serino protease extracelular de Chromobacterium violaceum em Escherichia coli

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Clonagem e expressão de provável serino protease extracelular de Chromobacterium violaceum em Escherichia coli

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Título Clonagem e expressão de provável serino protease extracelular de Chromobacterium violaceum em Escherichia coli
Autor Fachinelli, Natália Pezzi
Orientador Zaha, Arnaldo
Data 2006
Nível Graduação
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Biociências. Curso de Ciências Biológicas: Ênfase Molecular, Celular e Funcional: Bacharelado.
Assunto Chromobacterium violaceum
Clonagem
Serino-proteases
Resumo Chromobacterium violaceum é uma bactéria gram-negativa de hábito saprófito, que vive em solos e águas de regiões tropicais e subtropicais, sendo que no Brasil é encontrada abundantemente nas águas do Rio Negro (Amazônia). Essa bactéria apresenta grande potencial para aplicações nas áreas de saúde, ecologia e indústria. Entre as potenciais aplicações encontram-se a produção de plásticos biodegradáveis, limpeza de áreas poluídas com metais pesados e acúmulo de partículas de ouro em áreas de mineração em processo livre de mercúrio. A partir do seqüenciamento completo do genoma de C. violaceum (GenBank AE016825), realizado pela Rede Nacional do Projeto Genoma Brasileiro, surgiram muitas perspectivas para o entendimento deste organismo e seu potencial biotecnológico. Para a realização deste trabalho foi selecionada uma seqüência codificadora de interesse para a expressão em Escherichia coli: CV2717 -provável serino protease extracelular. A partir do DNAgenômico de C. violaceum ATCC 12472, a CDS de cv2717 foi amplificação porPCR e clonada em blunt no vetor de expressão pGEX-4T2. A expressão da proteína recombinante, na forma de fusão com glutationa-S-transferase (GST), se deu em condições de multiplicação celular a 37°C e de indução com 0,1 mM de IPTG por 3 h. Devido a expressão da proteína recombinante na fração insolúvel, diversas tentativas de solubilização foram testadas. A proteína recombinante foi visualizada na fração solúvel quando expressa na cepa AD494 de E. co li, após a utilização de detergentes sarcosil e Triton X-1 00. A proteína recombinante produzida será utilizada em ensaios funcionais para verificar a atividade de protease e posterior caracterização estrutural.
Abstract Chromobacterium viofaceum is a Gram-negative bacterium with saprophytic habits, found in tropical and subtropical regions, including the water and banks of the Rio Negro (Amazonian). This bacterium reveals great potential for medicai application, ecological and industrial purposes. Biodegradable plastic production, cleaning of areas polluted by heavy metais and solubilization of gold through mercury-free processes are among the possible uses of this organism. After the complete genome sequencing of C. violaceum (GenBank AEO 16825), made by the Brazilian National Genome Project Consortium, many perspectives for the understanding of this organism and its biotechnological potential appeared. For this work, a coding sequence of interest (CV2717 - probable extracellular serine protease) was selected for expression in Escherichia co/i. The strategy adopted for cloning was the amplification of the codifying sequence by PCR, and posterior blunt cloning in the pGEX- 4T2 expression vector. The recombinant protein's expression, in the glutathione-S-transferase (GST) fusion form, happened in cell multiplying conditions at 3rC, and in induction conditions, with O, 1 mM ofiPTG for three hours. Dueto the recombinant pro te in' s expression in the insoluble fraction, many attempts of solubilizing were tested. This protein was seeing in the soluble fraction when expressed in the E. coli AD494 strain, after the employment of sarkosyl and Triton X-100 detergents. The recombinant protein may possibly be used in functional essays to verifY the protease activity and for further structural characterization.
Tipo Trabalho de conclusão de graduação
URI http://hdl.handle.net/10183/159463
Arquivos Descrição Formato
000578664.pdf (15.03Mb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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