Ressequenciamento genômico de soja (Glycine max (L.) Merr.) e identificação de genes relacionados à tolerância ao alagamento do solo

Abstract

O cultivo da soja (Glycine max (L.) Merr.) em áreas de várzea surgiu como alternativa à monocultura de arroz, uma vez que cultivares com diferentes níveis de tolerância ao alagamento do solo foram identificadas. As tecnologias de sequenciamento de nova geração apresentam como vantagens o elevado volume de informações obtidas e uma visão direta na variação do DNA. Assim, é possível identificar polimorfismos e diferenciar genótipos quanto à característica de interesse. O objetivo deste trabalho foi ressequenciar e montar o genoma de duas cultivares de soja contrastantes para o caráter tolerância ao alagamento do solo, avaliar a expressão de genes candidatos e identificar alterações não sinônimas nas sequências gênicas. O DNA total das cultivares Introdução 27 (tolerante) e BRS 154 (sensível) foi extraído de folhas jovens. Ao DNA fragmentado e purificado foram adicionados indexadores e adaptadores conhecidos. Fragmentos com ~300pb foram selecionados e então realizado o sequenciamento pareado. As leituras de sequenciamento foram submetidas à verificação de qualidade das bases e a montagem foi realizada com os montadores ABySS, SOAPdenovo e a combinação Velvet e SSPACE. Para análise de RTqPCR foram escolhidos como candidatos à tolerância ao encharcamento do solo genes relacionados a rotas de captação de energia (ENO, ADH1, ALAT2 e GLB1), formação de estruturas associadas ao estresse (XETP e LBD41) e detoxificação celular (APX2). O alinhamento dos scaffolds gerados pelo montador AbySS e o genoma de referência da cv. Williams 82 foi realizado para reconstruir a sequência destes genes e as alterações não sinônimas foram identificadas. O sequenciamento gerou em média 111 milhões de leituras pareadas. A distribuição da qualidade das bases nas leituras foi elevada (e≥28) e adaptadores residuais não foram identificados. O programa ABySS mostrou maior eficiência na montagem dos genomas das cultivares Introdução 27 e BRS 154, gerando scaffolds maiores, com tamanho total de 1,024Gb e 1,020Gb, respectivamente. A taxa de alinhamento global das leituras com o genoma de referência foi de 97%. De maneira geral, a cultivar Introdução 27 apresentou maior expressão relativa de todos os genes avaliados. Alteração não sinônima entre os genótipos estudados foi constatada apenas no gene APX2 e diferenças na região promotora associada ao estresse foi constatada apenas no gene ALAT2. Dessa forma, não foi possível explicar as diferenças de expressão observadas, sugerindo uma maior complexidade do caráter estudado.

Soybean (Glycine max (L.) Merr.) in lowland areas emerged as alternative to rice monoculture, since cultivars with different levels of soil flooding tolerance have been identified. The next generation sequencing technologies generates high volume of data and a direct view of DNA variation. So, it is possible to identify polymorphisms and differentiate genotypes for traits of interest. The objective of this work was to resequence and assemble the genome of two contrasting soybean cultivars to soil flooding, to evaluate the expression of candidate genes and to identify non-synonymous changes in these gene sequences. Whole DNA of Introduction 27 and BRS 154 cultivars was extracted from young leaves. Indexers and adapters were added to fragmented and purified DNA. Fragments with ~300bp were selected and then pair-end sequencing was performed. Reads of sequencing were submitted to bases quality check and the assembly was performed with the ABySS, SOAPdenovo assemblers and the combination of Velvet and SSPACE. Candidate genes to soil flooding tolerance were submitted to RT-qPCR analysis. These genes were related to energy uptake routes (ENO, ADH1, ALAT2 and GLB1), formation of stress-associated structures (XETP and LBD41) and cell detoxification (APX2). The alignment of the scaffolds generated by the AbySS assembler and the cv. Williams 82 was performed to reconstruct the sequence of these genes and the non-synonymous changes were identified. Sequencing generated on average 111 million pair-end reads. The distribution of base quality in the reads was high (e≥28) and residual adapters were not identified. The ABySS program showed higher efficiency in assembling the genomes of Introduction 27 and BRS 154 cultivars, generating larger scaffolds, with a total size of 1.024Gb and 1.020Gb, respectively. The overall rate of alignment to reads with reference genome was 97%. In general, Introduction 27 cultivar presented the highest relative expression of all evaluated genes. Non-synonym alteration among the studied genotypes was observed only in the APX2 gene and differences in the promoter region associated with stress were found only in the ALAT2 gene. This way, was not possible to explain the differences in expression observed, suggesting a larger complexity in the studied trait.