A interação diferencial da proteína de choque térmico de 70kDa com o receptor dos produtos finais de glicação avançada e toll-like 4: uma relação com suas diferentes conformações e com o estado redox

Abstract

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica.

Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.