O complexo lipolítico de Metarhizium anisopliae e sua relação com o processo de infecção de hospedeiros artrópodes

Abstract

Lipases (triacilglicerol acilhidrolases, EC 3.1.1.3) são serino hidrolases de considerável relevância fisiológica e potencial uso industrial. O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é um dos mais importantes e bem estudados agentes biológicos para o controle de muitos artrópodes-praga. Lipases secretadas por M. anisopliae podem estar potencialmente envolvidas no processo de infecção do hospedeiro, porém, estudos sobre estas enzimas vêm sendo negligenciados principalmente em fungos patogênicos. Neste trabalho, investigamos o complexo lipolítico de M. anisopliae relacionado com a infecção de hospedeiros artrópodes. M. anisopliae foi eficiente no controle da aranha marrom, Loxosceles sp., uma importante praga com grande impacto na saúde pública e também um modelo aracnídeo alternativo para bioensaios. Uma mortalidade de 100% para indivíduos juvenis foi observada em 12 dias e 9 dias para adultos usando 109 conidios.mL-¹ com valores de LT50 de 8,35 dias e 6,57 dias respectivamente. Além disso, diferentes fontes de carbono, como constituintes da cutícula de artrópodes, influem na secreção de enzimas lipolíticas por M. anisopliae. Valores altos de atividade lipolítica foram induzidos em meios de cultura contendo constituintes do tegumento de artrópodes, quitina e estereato de colesteril. Em zimogramas, muitas bandas de atividade lipolítica foram observadas em todos os meios de cultura testados. Uma lipase de superfície de esporo de M. anisopliae (MASSL) fortemente associada à superfície do esporo do fungo foi purificada e caracterizada. Análises eletroforéticas mostraram que a massa molecular desta lipase é ~66 kDa e o pl 5,6. O seqüenciamento da proteína revelou que os peptídeos identificados em MASSL compartilham identidade com muitas lipases ou sequências relacionadas à lipases. A enzima foi capaz de hidrolisar muitos substratos com alguma preferência por esteres com cadeia de ácido graxo curta. Os valores de Km e Vmax para os substratos ρNP palmitato (ρNPP) e ρNP laurato foram respectivamente 0,474 mM and 1,093 mMol.min-¹.mg-¹ e 0,712 mM e 5,696 mMol.min-¹.mg-¹. A temperatura ótima da lipase purificada foi de 30 °C e a enzima foi mais estável em valores de pH mais ácidos (pH 3–6). A atividade de MASSL foi estimulada por Ca²+, Mg²+ e Co²+ e inibida por Mn²+. O efeito inibitório na atividade exercido por EDTA e EGTA foi limitado, enquanto o inibidor de lipase ebelactone B inibiu completamente MASSL. Metanol 0,5% aparentemente não afetou a atividade enquanto β-mercaptoetanol ativou a enzima. Anticorpos contra MASSL foram produzidos e análises de western blot sugerem que o anticorpo é específico para lipase. Este trabalho também apresenta o perfil de atividade de lipase durante o processo de infecção do carrapato Rhipicephalus microplus e o efeito do inibidor de lipase ebelactona B na infecção. Durante a exposição dos carrapatos aos esporos a atividade de lipase aumenta de 0,03 a 0,312 U usando ρNPP como substrato. Em zimogramas, bandas de atividade lipolítica foram detectadas em carrapatos tratados com esporos sem inibidor. O tratamento prévio dos esporos com o inibidor de atividade de lipase inibiu completamente a atividade lipolítica e preveniu a infecção do hospedeiro R. microplus. Os resultados apresentados neste trabalho são avanços importantes na elucidação da função desempenhada pelas lipases no processo de infecção do hospedeiro de M. anisopliae.

Lipases (triacylglycerol acylhydrolases, EC 3.1.1.3) are serine hydrolases of considerable physiological significance and industrial potential. The filamentous fungus Metarhizium anisopliae is one of the most important and beststudied biological agents for the control of many arthropod pests. Lipases secreted by M. anisopliae could potentially be involved in the host infection process, but studies about these enzymes have been neglected, mainly in fungi. In this work, we investigated the lipolytic complex of M. anisopliae related with infection of arthropod hosts. For this purpose, we attested the efficiency of M. anisopliae to control the brown spider, Loxosceles sp., an important plague with great impact on public health, as an alternative arachnid model other than the cattle tick for bioassays. A mortality rate of 100% for juvenile Loxosceles sp. was observed 12 days after application and 9 days for adults, using 109 conidia.mL-¹ with LT50 values of 8.35 days and 6.57 days, respectively. We also evaluated the effects of different carbon sources, such as components of the arthropod cuticles, on the secretion of lipolytic enzymes by M. anisopliae. Higher values of lipolytic activities were induced in the culture media containing arthropod tegument constituents chitin and cholesteryl stearate. In zymograms, several lipolytic activity bands were observed in all culture media tested. An M. anisopliae spore surface lipase (MASSL) strongly bound to the fungal spore surface has been purified and characterized. Electrophoretic analyses showed that the molecular weight of this lipase is ~66 kDa and pl is 5.6. Protein sequencing revealed that identified peptides in MASSL shared identity with several lipases or lipase-related sequences. The enzyme was able to hydrolyze several substrates, with some preference for esters with a short acyl chain. The values of Km and Vmax for the substrates ρNP palmitate (ρNPP) and ρNP laurate were respectively 0.474 mM and 1.093 mMol.min-¹.mg-¹ and 0.712 mM and 5.696 mMol.min-¹.mg-¹. The optimum temperature of the purified lipase was 30 °C and the enzyme was most stable within the most acid pH range (pH 3-6). MASSL activity was stimulated by Ca²+, Mg²+ and Co²+ and inhibited by Mn²+. The inhibitory effect on activity exerted by EDTA and EGTA was limited, while the lipase inhibitor Ebelactone B completely inhibited MASSL. Methanol 0.5% apparently did not affect MASSL activity while β-mercaptoethanol activated the enzyme. Antibodies against MASSL were produced and western blot analysis suggests that the antibody is lipase specific. This work presents also the lipase activity profile during the host infection process of tick Rhipicephalus microplus and the effect of lipase activity inhibitor ebelactone B on infection. During the course of tick exposure to spores lipase, activity increased from 0.03 to 0.312 U, using ρNPP as substrate. In zymograms, bands of lipase activity were detected in ticks treated with spores without inhibitor. The previous treatment of spores with lipase activity inhibitor completely inhibited lipolytic activity, and prevented the infection of the R. microplus host. We hope that results presented in this work will contribute to elucidate the role played by lipases in M. anisopliae host infection process.