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Evolução in vitro de moléculas cry ativas contra Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda

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Evolução in vitro de moléculas cry ativas contra Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda

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Título Evolução in vitro de moléculas cry ativas contra Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda
Autor Oliveira, Gustavo Ramos de
Orientador Grossi-de-Sá, Maria Fátima
Co-orientador Silva, Maria Cristina Mattar da
Data 2008
Nível Mestrado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Algodão
Plantas transgênicas
Pragas : Controle
Resumo Bacillus thuringiensis é uma bactéria gram-positiva que produz cristais protéicos durante a fase de esporulação. Os cristais, são formados por proteínas Cry e apresentam atividade tóxica específica a determinadas classes de insetospraga, sendo o seu uso bastante difundido na agricultura. O presente trabalho teve como objetivo gerar uma biblioteca de variantes, do gene cry8Ha1, isolado da estirpe S811 de B. thuringiensis e selecionar variantes com atividade melhorada para pragas do algodoeiro. A biblioteca foi construída por meio da técnica de DNA shuffling e selecionada contra os insetos-praga Anthonomus grandis e Spodoptera frugiperda pela técnica de Phage display. As variantes foram selecionadas pela afinidade aos receptores presentes nas membranas dos intestinos do bicudo-do-algodoeiro (A.grandis) e da lagarta-do-cartucho (S. frugiperda), principais pragas do algodoeiro. Após expressão em fago, proteínas variantes foram testadas em bioensaios contra larvas dos insetos-alvo (A. grandis e S. frugiperda) e seqüenciadas. Os resultados de atividade, mostraram variantes mais efetivas para as duas pragas-alvo, quando comparado com a proteína original Cry8Ha1. O mutante Cry/BI-25 (ativo contra A. grandis) foi selecionado, por diferir estatisticamente do controle, e subclonado no vetor de expressão em bactéria. A proteína foi purificada e utilizada em bioensaio contra larvas de A. grandis. Os resultados indicaram um aumento de atividade entomotóxica de 333% da proteína mutante (Cry/BI-25) quando comparada com a proteína original (Cry8Ha1). A nova molécula, Cry/BI-25, está sendo utilizada em programas de melhoramento de plantas de algodão visando a obtenção de plantas resistentes à praga-alvo.
Abstract Bacillus thuringiensis is a gram-positive bacterium that produces protein crystals during its sporulation phase. These crystals are formed by Cry proteins that show specific toxicity to some insect-pest classes, which makes their use very common in agriculture. This work aimed at obtaining a library of cry8Ha1 gene variants, isolated from B. thuringiensis S811 and the selection of gene variants, whose products would have an improved insecticidal activity against cotton insect-pests. The library was constructed using DNA shuffling and selected against the insectpests Anthonomus grandis and Spodoptera frugiperda using Phage display. The variants were selected by affinity to Brush Border Membrane Vesicles (BBMVs) of A. grandis and S. frugiperda midguts. After phage expression, variant proteins were tested in bioassays against the target insects and their genes sequenced. The mutant Cry/BI-25 showed higher insecticidal activity against A. grandis and was subcloned to a bacterium expression vector. The purified expressed protein Cry/BI-25 is 333% more active when compared with protein original (Cry8Ha1). Gene variants selected against S. frugiperda are still under analysis. The new improved protein Cry/BI-25 will be used in cotton plant transformation experiments, with the purpose of developing insect-pest resistant GM cotton plants.
Tipo Dissertação
URI http://hdl.handle.net/10183/17352
Arquivos Descrição Formato
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