Determinação da densidade celular da cianobactéria Microcystis aeruginosa por espectrofotometria : validação de um método para uso em pesquisa

Abstract

A pesquisa em cianobactérias é intensa e tem progredido muito com o desenvolvimento de novas tecnologias e técnicas. Em projetos envolvendo culturas de cianobactérias, sua quantificação precisa e exata é imprescindível, pois diversos aspectos de sua biologia dependem de sua densidade celular. Neste trabalho estabeleceu-se um método espectrofotométrico de contagem rápida e eficiente, para ser aplicado a culturas da cianobactéria tóxica Microcystis aeruginosa, da cepa brasileira NPLJ-4, para uso em pesquisa. No espectrofotômetro de UV Cary-1E foram feitas medições de absorbância no pico de absorção da amostra, determinado experimentalmente a 436nm. A matriz utilizada (branco) foi o meio de cultura ASM- 1, uma solução de 0,4% de diferentes sais. As absorbâncias foram correlacionadas com os resultados de contagens de células em câmera de Sedgwick-Rafter, em diferentes faixas de trabalho, tanto em análises de correlação linear como de potência. A avaliação dos resultados foi realizada através de gráficos de perfil de resíduos, que demonstram se há tendência nas predições das equações geradas em cada correlação. A regressão linear, quando separada em altas e baixas concentrações celulares, mostrou-se a mais precisa. As equações de regressão x= (y/4.10-8) - 0,0357 e x= (y/7.10-8) + 0,0012 mostram qual é o número esperado de células, em altas e baixas concentrações (respectivamente), para uma absorbância y. A equação na faixa de altas concentrações deve ser utilizada para densidades acima de 1.230.000 células.mL-1, o que equivale a um valor de absorbância 0,0850, sendo valores de concentração celular e absorbância mais baixos melhor preditos pela equação de baixas concentrações. Também foram determinados os limites de detecção e quantificação do novo método. Os resultados esperados pelas equações e observados nas contagens foram avaliados através de um teste F, que mostrou que as variâncias não diferem (Fcalc=1,90< F0,05;6;6=5,82 para os resultados das equações de maiores concentrações e Fcalc=1,68< F0,05;6;6=5,82 para os resultados das equações de menores concentrações). Conclui-se que os resultados esperados das equações são similares aos resultados das contagens, comprovando que o novo método está validado e pode ser aplicado eficientemente. Este método, apesar de estar restrito a apenas uma linhagem tóxica, é muito mais ágil do que o método de quantificaçõa em câmara de Sedgwick-Rafter, mostrando-se muito promissor e de grande utilidade para a pesquisa.

Research in cianobacteria is intense, and has progressed much with the development of new technologies and techniques. In projects involving cianobacteria cultures, it's precise quantification is paramount, since several aspects of it's biology rely on cellular density. In this work, a fast and precise spectrophotometric cell quantification method has been established, to be applied in research using cultures of the toxic cianobacteria Microcystis aeruginosa, of the brazilian cell line NPLJ-4. Absorbance readings using the Cary-1E UV spectrophotometer where made in the sample's absorption peak, empirically determined at 436nm. The culture medium ASM-1, wich is a solution of 0,4% different salts, was used as the matrix (blank). Absorbance values were correlated to Sedegewick-Rafter chamber cell countings results, in different work ranges, in both linear and power correlation analysis. Results were analyzed through residues profile charts, which reveals any bias on the predictions of the correlation equations. Linear regression, when separated in high and low cell densities, was found to be more accurate. The regression equations x= (y/4.10-8) - 0,0357 and x= (y/7.10-8) + 0,0012 show the expected cell number in high and low cellular concentrations (respectively), for a y absorbance. The high cellular concentration equation should be used for cellular densities above 1.230.000 cells.mL-1, which reflects an absorbance value of 0,0850, being lower cellular concentrations and absorbance values better fit for the low cellular concentration equation. Quantification and detection limits were also determined for the new method. The results obtained from counting chamber where compared to the results expected by the different equations using a F test, which has shown that variances were not different (Fcalc=1,90< F0,05;6;6=5,82 for high concentrations equation results and Fcalc=1,68< F0,05;6;6=5,82 for low concentration equation results). It has been concluded that the expected results from the equations are similar to the results of the countings, showing that the new method may be efficiently applied and it's validated. Alltough being restricted to a single toxic cell line, the new method is much faster than the Sedgwick-Rafter chamber cell counting method, and therefore is very promising and has great uses for research.