Análise de genes de referência para estudos de expressão gênica em Eucalyptus globulus Labill durante o processo de enraizamento adventício através da técnica de PCR Quantitativo em Tempo Real

Abstract

O enraizamento adventício é uma etapa crucial na propagação vegetativa de plantas lenhosas de interesse econômico como o eucalipto. Eucalyptus globulus e seus híbridos interespecíficos possuem recalcitrância ao enraizamento, porém são de grande interesse para a região Sul, devido ao baixo teor de lignina e tolerância à geada. Um melhor entendimento deste processo poderia auxiliar na engenharia genética desta espécie melhorando a produtividade das florestas plantadas. O PCR Quantitativo em Tempo Real é o método de maior sensibilidade e especificidade na análise de transcritos atualmente. Através dele é possível analisar a expressão de genes de interesse em determinada condição experimental. Entretanto, a confiabilidade dos resultados depende da escolha correta do gene de referência, o qual deve apresentar uma expressão constitutiva em todos os tratamentos. Trabalhos recentes demonstram que não há nenhum gene universalmente constitutivo, portanto vários algoritmos foram desenvolvidos para auxiliar na validação de genes-referência. Neste trabalho, sete genes considerados constitutivos foram analisados em diferentes amostras de E. globulus ao longo das fases do enraizamento adventício in vitro através do software geNorm. Os resultados indicaram NADP-Isocitrato desidrogenase (IDH) como o gene mais estável juntamente com uma suposta proteína de ligação a RNAs (EUC12), seguidos de uma proteína da família SAND (SAND). Genes tradicionalmente utilizados como referências em estudos com plantas como α-Tubulina (TUA), Gliceraldeído-3- fosfato desidrogenase (GAPDH), Poliubiquitina (PUBQ) e Ribonucleoproteína L23 (RIB) apresentaram expressão altamente variável e não são recomendados para uso como referências em E. globulus durante o enraizamento adventício. A expressão de um possível ortólogo ao gene Argonauta 1 (AGO1) de Arabidopsis thaliana em E. globulus, provavelmente envolvido com a regulação de alguns fatores de resposta à auxina (ARFs), foi analisada utilizando como referências o gene mais estável e o mais variável dentre as análises, o que resultou em padrões diferentes de expressão. Este resultado confirma a importância da escolha adequada do gene de referência em estudos de expressão gênica, permitindo a confiabilidade dos resultados.

Adventitious rooting is an essential step on the vegetative propagation of woody plants of economic interest like eucalyptus. Eucalyptus globulus and its interespecific hybrids show rooting recalcitrance; however, these genotypes are of great interest to southern Brazil, due their low lignin content and frost tolerance. A better understanding of adventitious rooting could help attempts to genetic engineering this species, improving plant forest productivity. Currently, the Quantitative Real Time PCR is the most sensitive and specific method for transcript analysis, allowing the evaluation of expression of genes of interest in a certain experimental condition. However, the accuracy of the results depends on the correct choice of the reference gene, which should have a constitutive expression during treatments. Recent studies have shown that there is no universal reference gene for all conditions and species, so several algorithms have been developed to help validate reference genes to particular situations. In this work, seven putative constitutive genes were investigated in different E. globulus samples throughout the in vitro adventitious rooting phases, using the geNorm software. The results indicated that NADP-Isocitrate dehydrogenase (IDH) is the most stable gene together with a putative RNA binding protein (EUC12), followed by a SAND family protein (SAND). Commonly used reference genes in plant studies such as α-Tubulin (TUA), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH), Polyubiquitin (PUBQ) e Ribonucleoprotein L23 (RIB) showed highly variable expression and are not recommended for use as constitutive controls in adventitious rooting of E. globulus. The expression of the putative ortologue of Arabidopsis thaliana Argonaute 1 (AGO1) in E. globulus, a gene involved in regulating auxin response factors (ARFs), was investigated using as reference genes those that displayed the most stable or the most variable expression profile, yielding distinct expression patterns. This result confirms the importance of appropriate reference gene choice in expression studies in order to afford reliable results.