Análise de fragmentos de RNA derivados de tRNA em Cryptococcus gattii

Abstract

Mecanismos de regulação da expressão gênica constituem um ponto chave de células e organismos, sendo fundamentais em diversos aspectos da funcionalidade celular, como quando expostos a estímulos e variações no ambiente. Neste contexto, moléculas de RNA não codificante também desempenham importantes funções. Recentemente, uma nova classe de pequenos RNAs com atividade regulatória pós-transcricional foi descrita em diversas espécies, sendo denominados fragmentos de RNA derivados de tRNAs (tRFs). Embora tRFs possuam uma função de regulação extremamente similar aos microRNAs, existem indícios de que tRFs exercem sua função independentemente da maquinaria celular utilizada pelos microRNAs na via de RNA de interferência (RNAi). As leveduras basidiomicéticas Cryptococcus gattii e Cryptococcus neoformans são os agentes etiológicos da criptococose, doença sistêmica que acomete principalmente pulmões e sistema nervoso central. É conhecido que algumas linhagens de C. gattii não possuem alguns genes envolvidos na via de RNAi, enquanto que C. neoformans, evolutivamente próximo a C. gattii, é proeficiente para esta via. Dessa forma, C. gattii apresenta um grande potencial como modelo de avaliação da independência dos tRFs da maquinaria de RNAi, o que poderia indicar a existência de uma via alternativa de regulação pós-transcricional nesta levedura. Assim, esse projeto teve por objetivo avaliar a presença de tRFs em C. gattii. Empregando metodologias in silico baseadas em dados de alinhamento de bibliotecas de pequenos RNAs, foram identificados 34 tRFs únicos para a linhagem R265 de C. gattii, originados de 23 das 53 sequências únicas de tRNAs preditas no genoma. Dentre estes, estão inclusos tRFs de uma possível nova classe, originada da região 5’leader do transcrito de tRNA primário. Por meio de ensaios de qRT-PCR, foram confirmadas as predições de tRFs representativos, além da identificação de expressão diferencial. Apesar da quantidade de tRNAs que geram tRFs ser extremamente baixa nesta levedura, quando comparada com outros organismos, a identificação de tRFs em uma linhagem de C. gattii que apresenta a inviabilidade da via de RNAi, e especialmente a evidência de expressão diferencial, sugerem a existência de regulação por meio de tRFs de forma independente da via de RNAi.

Gene expression regulation mechanisms are a key point for cells and organisms and essential to several aspects of cellular functionality, as those necessary to adapt to stimuli and variations on the environment. In this context, noncoding RNA molecules also have an important role. Recently, a new class of small RNAs with post-transcriptional regulatory activity was described in various species, known as tRNA-derived RNA fragments (tRFs). Although tRFs possess a regulation function extremely similar to microRNAs, there are indications that tRFs exert their functions independently of cellular machinery used by microRNAs in RNA interference pathway (RNAi). The basidiomycetous yeasts Cryptococcus gattii and Cryptococcus neoformans are the etiologic agents of cryptococcosis, a systemic disease which affects mainly the lungs and central nervous system. Some strains of C. gattii do not possess genes involved in RNAi pathway, while the evolutionarily close C. neoformans is proficient in such pathway. Therefore, C. gattii displays a great potential as a model for evaluation of tRFs RNAi machinery independent activity, which could point to an alternative post-transcriptional regulation pathway existence. Therefore, the aim of this work was to evaluate the presence of tRFs in C. gattii R265. Using in silico methodologies based on alignment data from small RNAs libraries, we identified 34 unique tRFs in C. gattii R265 strain, originated from 23 out of the 53 unique sequences of genome predicted tRNAs. Among these are tRFs of a possible new class, derived from the 5’ leader region of primary tRNA transcript. With qRT-PCR assays, we were able to confirm the prediction of representative tRFs, as well as identifying differential expression of some tRFs. Although the number of tRF-producing tRNAs identified was lower compared to other organisms, the tRFs identification in a RNAi pathway-disabled strain of C. gattii, and especially the evidence of differential expression, suggest the existence of a RNAi pathway-independent regulation by the tRFs.