Efeito do probiótico Lactobacillus rhamnosus GG em componentes do inflamassoma NLRP3 e da permeabilidade intestinal em modelo de doença hepática alcoólica

Abstract

Introdução: A doença hepática alcóolica (DHA), causada pelo consumo excessivo de álcool, está entre as principais causas de morte por doenças hepáticas no mundo. A DHA pode apresentar-se na forma aguda (hepatite alcoólica) ou crônica (esteatose, esteato-hepatite, fibrose e cirrose). Dentre os fatores envolvidos na patogênese da DHA, tanto os inflamassomas como o aumento da permeabilidade intestinal, têm sido implicados no desenvolvimento de fibrose hepática. Objetivos: Avaliar o efeito da suplementação com probiótico Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) sobre o acúmulo de lipídios hepáticos, na ativação dos marcadores dos inflamassomas e de permeabilidade intestinal em modelo experimental de DHA com zebrafish. Metodologia: Foi realizado experimento preliminar para avaliar a dose efetiva de LGG capaz de promover colonização intestinal no zebrafish adulto, wild-type. Os peixes foram divididos em quatro grupos (8 animais/grupo), sendo que 3 grupos receberam diferentes doses de LGG (0.4; 1; e 2 mg LGG/peixe/dia) e um grupo recebeu apenas ração, sem probiótico por 14 dias. Foram empregadas técnicas de análise de Gram, análise microbiológica e reação em cadeia da polimerase (PCR). Definida a dose, um novo experimento foi realizado e os animais divididos em três grupos (n = 64/grupo): Grupo etanol (E), Grupo etanol + probiótico (EP) - suplementado com 1mg LGG/peixe/dia, e grupo controle (C) - sem etanol e sem LGG. Os grupos E e EP foram expostos a uma concentração alcoólica de 0,5% por 28 dias. Ao final deste período, todos os animais foram eutanasiados sob anestesia, e os fígados foram coletados para coloração de Oil Red e avaliação do sistema inflamassoma através dos marcadores Pycard, Fator de Necrose Tumoral-α (tnf-α), Caspase, Interleucina-10 (il-10) e Interleucina-1β (il-1β). Os intestinos foram coletados para avaliação dos marcadores de permeabilidade intestinal Claudina (cldn)-c, cldn15a, cldn15b e F11 8 Receptor (f11r). Resultados: Os testes de colonização indicaram que as doses 1 e 2 mg promoveram colonização intestinal após 14 dias, sendo a dose escolhida a dose mínima de 1mg LGG/peixe/dia. Ao final do segundo experimento, o Grupo EP, apresentou menor acumulação de lipídios hepáticos, menor expressão de il-1β e maior expressão de cldn15a quando comparado ao Grupo E. Conclusões: Foi possível verificar que a suplementação de probióticos com LGG foi protetora para a esteatose hepática em peixes expostos ao etanol. Além disso, o LGG teve ação na modulação da resposta inflamatória, promovendo diminuição da citocina pró-inflamatória il-1β e de marcadores de permeabilidade intestinal, principalmente cldn15a, melhorando a integridade da barreira intestinal.

Alcoholic liver disease (ALD), caused by excessive alcohol consumption, is among the leading causes of death from liver disease in the world. Among the factors involved in the pathogenesis of ALD, both inflammasomes and increased gut permeability, have been linked in the development of hepatic fibrosis. Objectives: To assess the effect of supplementation with probiotic Lactobacillus rhamnosus GG (LGG) on the accumulation of hepatic lipids, in the activation of inflammasomes and gut permeability markers in experimental model of ALD with zebrafish. Methodology: A preliminary experiment was conducted to assess the effective dose of LGG capable of promoting intestinal colonization in adult wild-type zebrafish. The fish were divided into four groups (8 animals/group), and 3 groups received different doses of LGG (0.4; 1, and 2 mg LGG/fish/day) and one group received only ration, without probiotic for 14 days. To achieve this assessment, gram analysis, microbiological analysis, and polymerase chain reaction (PCR) techniques were used. When the dose was set, a new experiment was done, animals were divided into three groups (n=64/group): Ethanol group (E), Ethanol + probiotic group (EP) - supplemented with 1mg LGG/fish/day, and control group (C) - without ethanol and without LGG. Groups E and EP were exposed to an alcohol concentration of 0.5% for 28 days. At the end of this period, all animals were euthanized under anesthesia, and livers were collected for Oil Red staining and assessment of the inflammasome system through Pycard, Tumor Necrosis Factor-α (tnf-α), Caspase, Interleukin-10 (il-10), and Interleukin-1β (il-1β) markers. Intestines were collected for evaluation of the gut permeability markers Claudine (cldn)-c, cldn15a, cldn15b, and F11 Receptor (f11r). Results: Colonization tests indicated that the 1 and 2 mg doses promoted intestinal colonization, and the minimum dose of 1 mg LGG/ fish/day was chosen. At the end of the second experiment, the Group EP 10 presented lower accumulation of hepatic lipids, lower il-1β expression and higher cldn15a expression when compared to Group E. Conclusions: Was possible to verify that the supplementation of probiotics with LGG was protective for hepatic steatosis in fish exposed to ethanol. In addition, LGG had an effect on the modulation of the inflammatory response, promoting the reduction of the proinflammatory cytokine il-1β and markers of intestinal permeability, mainly cldn15a, improving the structure of the gut barrier.