Estudo de biotransformação in vitro da ambrisentana e da rifampicina através de fungos filamentosos

Abstract

A biotransformação de fármacos através de microrganismos é considerada uma tecnologia econômica e ecologicamente viável, sendo muito utilizada para modificar estruturas de compostos biologicamente ativos, estudar o metabolismo de novos fármacos e eliminar ou reduzir sua toxicidade. Estes estudos constituem uma alternativa promissora para elucidação dos metabólitos formados de diferentes classes farmacológicas. Este trabalho teve como objetivo empregar três diferentes fungos filamentosos: Cunninghamella elegans, Penicillium mineoluteum e Aspergillus niger, para estudar a biotransformação dos fármacos ambrisentana e rifampicina. Os fármacos foram escolhidos por apresentarem metabolismo via CYP450 e também por não haver relatos na literatura sobre estes estudos. Para o monitoramento da formação dos metabólitos foi necessário desenvolver metodologias analíticas com características adequadas para esta aplicação. O monitoramento da formação dos metabólitos foi empregado por cromatografia líquida de alta eficiência e para identificação destes foi empregado cromatografia líquida de ultra eficiência acoplada à espectrometria de massas sequencial (UHPLC-QTOF/MS). O Capítulo I apresenta a biotransformação da ambrisentana (AMB) através do fungo Cunnighamella elegans ATCC 9245. Primeiramente, foi realizada a otimização do estudo (meio de cultura, pH, concentração do fármaco e agitação) para identificar da melhor condição de biocatálise. A metodologia analítica para monitoramento dos metabólitos formados foi desenvolvida e validada. A biotransformação da AMB resultou na formação de um metabólito conhecido como glicosídeo da ambrisentana (C28H33N2O9), ainda não relatado na literatura, confirmado a capacidade do fungo em realizar fase II do metabolismo. O Capítulo II apresenta os resultados obtidos no estudo de biotransformação utilizando o mesmo fungo filamentoso para o fármaco rifampicina (RIF). A concentração de inóculo foi otimizada (1016 esporos), a fim de verificar o aumento na formação dos possíveis metabólitos. Os resultados relacionados à RIF mostram que ocorre o consumo do fármaco pela C. elegans, representado pela redução da concentração do mesmo, assim como formação de um metabólito já conhecido como produto de degradação, em maior concentração no meio biotransformado quando comparado com o controle negativo. Além disso, foi observada a presença de picos adicionais não observados nos controles. Posteriormente, as amostras foram analisadas em UHPLC-QTOF/MS para a elucidação estrutural dos sinais formados. Com isso, foi identificada a rifampicina quinona e um sinal de menor polaridade formado somente no meio de biotransformação (452 m/z), o qual foi proposto como uma mono-oxigenação da RIF. No Capítulo III, foi realizado o estudo de biotransformação da ambrisentana através dos fungos Aspergillus niger ATCC 9029 e Penicilium mineoluteum URM 6889, empregando meio de cultura Czapek. No meio reacional com o A.niger, ocorre formação de dois sinais mais polares que o fármaco, indicando a formação de possíveis metabólitos, que foram elucidados através da UHPLC-QTOF/MS. Foi possível propor dois metabólitos ainda não relatados na literatura de m/z 301,1339 e 313,1907, respectivamente. Entretanto, a biocatálise através do P.mineoluteum não apresentou formação de sinais adicionais quando comparado aos controles. No Capítulo IV, são apresentados os resultados obtidos da biotransformação da RIF através do fungo A.niger. O fungo foi capaz de reduzir drasticamente a concentração de RIF em meio reacional. Devido a isto, a amostra foi avaliada em UHPLC-QTOF/MS para verificar a possível formação de metabólitos. Foi observada a formação de dois compostos mais polares que a RIF com mesma massa e fragmentação (455.3115 m/z), caracterizando isômeros, além da RIF quinona. Posteriormente, foi investigada a atividade antimicrobiana da RIF após transformação através do método da microdiluição em poços preconizados por guia internacional, resultando em aumento da concentração inibitória mínima, consequentemente perda da atividade antimicrobiana. Os resultados obtidos neste estudo demonstram que biostranformações com fungos são uma importante alternativa para mimetizar a biotransformação em humanos e também para obtenção de metabólitos de fármacos. Os dois fungos propostos nesse estudo Cunninghamella elegans ATCC 9245 e Aspergillus niger ATCC 9029 apresentaram capacidade de metabolizar os fármacos ambrisentana e rifampicina.

Biotransformation of drugs by microorganisms is an economical and ecologically viable technology and is widely used to modify structures of some biologically active compounds, study the metabolism of molecules and eliminate or reduce their toxicity. These studies constitute a promising alternative for the elucidation of metabolites formed from different pharmacological classes. This work aims to employ three different filamentous fungi: Cunninghamella elegans, Penicillium mineoluteum e Aspergillus niger, to study the biotransformation of the drugs ambrisentan and rifampicin. These drugs were chosen because they have metabolism through CYP450 and also there are no reports in the literature about these studies. To monitor the formation of metabolites, it was necessary to develop and validate analytical methodologies with characteristics suitable for this application. High performance liquid chromatography was used to monitor the formation of the metabolites, and ultra-high performance liquid chromatography coupled to sequential mass spectrometry (UHPLC-QTOF/MS) was used to identify the metabolites. The first chapter presents the optimization of the study (culture medium, pH, drug concentration and agitation), the results obtained in the biotransformation of ambrisentan by the fungus Cunnighamella elegans ATCC 9245 in Czapek medium, the development and validation of the analytical methodology for monitoring the metabolites formed and the identification of their molecular structures. The biotransformation of AMB resulted in the formation of a metabolite known as ambrisentan glycoside (C28H33N2O9), not reported yet in the literature, confirming the ability of the fungus to perform phase II metabolism. Chapter II presents the results obtained in the biotransformation study using the same filamentous fungus for the drug rifampicin (RIF). The inoculum concentration was optimized (1016 spores) in order to verify the increase in the formation of the possible metabolites. The results related to RIF show that the consumption of the drug by C.elegans, represented by the reduction of the concentration of the drug, as well as the formation of a metabolite already known as degradation product, in a higher concentration in the biotransformed medium when compared to the negative control. In addition, the presence of additional peaks not observed in the controls was demonstrated. Subsequently the samples were analyzed in UHPLC-QTOF/MS for the structural elucidation of the formed signals. With this, rifampicin quinone was identified along to another compound of lower polarity formed only in the biotransformation medium (452 m/z), which was proposed as a mono-oxygenation of the RIF. In Chapter III, the biotransformation of ambrisentan was carried out through the fungus Aspergillus niger ATCC 9029 and Penicilium mineoluteum URM 6889, using Czapek culture medium. In the reaction medium with A.niger, formation of two more polar signals than the drug was observed, indicating the formation of possible metabolites, which were elucidated through UHPLC-QTOF/MS. It was possible to propose two metabolites not yet reported in the literature, with m/z 301.1339 and 313.1907, respectively. However, the biocatalysis through P.mineoluteum showed no additional signal formation when compared to the controls. In Chapter IV, the results obtained from the biotransformation of the RIF through the A.niger fungus are presented. The fungus was able to drastically reduce the concentration of RIF in reaction medium. Due to this, the sample was evaluated in UHPLC-QTOF/MS to verify the possible formation of metabolites. It was observed the formation of two more polar compounds than the RIF with the same mass and fragmentation (455.3115 m/z), characterizing isomers, besides RIF quinone. Subsequently, the antimicrobial activity of RIF was evaluated after transformation through the microdilution method in wells recommended by international guidelines, resulting in an increase in the minimum inhibitory concentration, consequently loss of antimicrobial activity. The results obtained in this study demonstrate that biotransformation with fungi are an important alternative to mimic the biotransformation in humans and also to obtain drug metabolites. The two fungi proposed in this study Cunninghamella elegans ATCC 9245 and Aspergillus niger ATCC 9029 were able to metabolize the drugs Ambrisentan and Rifampicin.