Caracterização filogenética das proteínas inativadoras de ribossomos (RIPs) de mamona (Ricinus communis L.) e análise da expressão dos genes Rcom RIPs durante o desenvolvimento da semente

Abstract

As Proteínas Inativadoras de Ribossomos (RIPs) compreendem uma família de enzimas que inibem a síntese protéica através da depurinação de uma adenina específica do RNA ribossomal. Os membros desta família são classificados como RIPs do tipo I, quando possuem somente o RNA-N-Glicosidase e RIPs do tipo II quando além do domínio glicosidase, também apresentam um domínio de lectina. As RIPs foram mais estudadas em plantas, onde a ricina e a aglutinina, ambas RIP do tipo II de mamona (Ricinus communis), estão entre as primeiras descritas. O presente trabalho teve o objetivo de identificar parálogos da ricina e aglutinina, bem como RIPs do tipo I de mamona e analisar as suas relações filogenéticas. Além disso, validar o uso de 14 potenciais genes de referência para qRT-PCR em cinco estádios do desenvolvimento da semente de mamona. O padrão de expressão gênica por RT-qPCR de todas RIPs de mamona identificadas, também foram analisados nestes mesmos estádios. Um total de 18 genes de RIPs foi identificado em mamona (Rcom RIPs), dos quais 10 foram classificados como do tipo II e 8 do tipo I. As topologias das árvores filogenéticas sugerem que as Rcom RIPs foram originadas a partir de múltiplos eventos de duplicação gênica. Dois modelos evolutivos foram propostos para a radiação das Rcom RIPs, baseados em processos de fusão gênica associado ou não a eventos de duplicação parcial. Os genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP e UBC foram os que apresentaram perfil de expressão mais estável e foram selecionados para subsequente normalização dos dados de expressão das Rcom RIPs. Os genes que codificam as Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 e 8 e as Rcom RIPII 1, 2, 4, 5, 6 e 8 são transcritos em sementes, sendo que a Rcom RIPII 1 (ricina) e a Rcom RIPII 2 (aglutinina) foram as mais expressas. O presente trabalho apresenta um modelo evolutivo das Rcom RIPs, o qual pode ser extrapolado para outras espécies de plantas. Este trabalho também demonstra o primeiro esforço para a padronização de genes de referência para RT-qPCR em mamona e o primeiro que apresenta a expressão outras Rcom RIPs, além da ricina e aglutinina.

Ribosome inactivating proteins (RIPs) comprise a family of enzymes that inhibit protein synthesis, after depurination of an adenine-specific ribosomal RNA. The members of this family are classified as type I RIPs, which have a RNA-Nglycosidase domain and type II RIPs encompassing a RNA-N-glycosidase and a lectin domain.The RIPs were more studied in plants, where ricin and agglutinin, both type II RIP of castor bean (Ricinus communis), were the first to be described. This work aimed to: 1) identifine paralogous of ricin and agglutinin, as well as the type I RIPs of castor bean; 2) analyze their phylogenetic relationships; 3) validate the use of 14 potential housekeeping genes for qRT-PCR for five developmental stages of R. communis seeds; 4) analyze the pattern of gene expression by RTqPCR of all RIPs castor identified in these same stages. A total of 18 genes that encode RIPs were identified in castor bean (Rcom RIPs), 10 of which were classified as type II and 8 as type I. The phylogenetic trees topologies suggest that Rcom RIPs were originated from multiple events of gene duplications. Two evolutionary models have been proposed for the radiation of Rcom RIPs based on gene fusion processes associated or not to events of partial duplication. The genes Act 2/7, EF β, Ubi, TIP and UBC presented the more stable expression profile and were selected for further RT- qPCR normalization experiments. The Rcom RIPI 3, 4, 5, 7 and 8 and Rcom RIPI 1, 2, 4, 5, 6 and 8 genes are actively transcribed in seeds, whereas the Rcom RIPI 1 (ricin) and Rcom RIPI 2 (agglutinin) were the most expressed. This paper presents an evolutionary model of Rcom RIPs, which can be extrapolated to other plant species. Also, corresponds to the first effort to standardize housekeeping genes for RT-qPCR in castor bean and the first that shows the expression Rcom RIPs, other than ricin and agglutinin.