Análise abrangente de variantes de GNPTAB associadas à atividade deficiente da GlcNAc-1-fosfotransferase

Abstract

As hidrolases lisossômicas são peptídeos sintetizados em ribossomos acoplados à membrana, e concomitantemente incorporados ao lúmen do retículo endoplasmático. Ainda nessa organela, essas proteínas são modificadas com oligossacarídeos padrão em resíduos de asparaginas contidos em sua estrutura primária. A geração de resíduos de manose-6-fosfato (M6P) nos oligossacarídeos presentes nas hidrolases lisossômicas garante o direcionamento destas aos compartimentos lisossomais. A primeira etapa da geração de M6P é realizada pela GlcNAc-1-fosfotransferase, que é residente da porção cis do complexo de Golgi, e realiza o reconhecimento das hidrolases e a transferência de um resíduo de GlcNAc-1-fosfato do doador UDP-GlcNAc para o resíduo de manose na posição 6 do oligossacarídeo presente na hidrolase. A GlcNAc-1-fosfotransferase é um complexo hexamérico formado por duas subunidades α, β e γ (α²β²γ²), onde as duas primeiras são codificadas pelo gene GNPTAB e a terceira pelo gene GNPTG. Variantes patogênicas identificadas no gene GNPTAB causam as doenças lisossômicas raras Mucolipidoses (ML) II e III alfa/beta, e variantes em GNPTG causam a ML III gama. Essas doenças são graves e caracterizadas por um extravasamento de hidrolases lisossômicas ao ambiente extracelular e, consequentemente, a ausência destas nos compartimentos lisossomais, o que ocasiona um acúmulo de macromoléculas não degradadas. Objetivos: 1) Caracterizar os mecanismos fisiopatológicos de variantes patogênicas de GNPTAB; 2) Caracterizar pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta em relação a variantes patogênicas em GNPTAB. Metodologia: Etapa 1 - estudo in vitro, no qual construtos contendo as variantes p.Asp76Gly, p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr, p.Arg986Cys e p.Leu1168Glnfs*5 do gene GNPTAB foram geradas através de mutagênese sítio-dirigida, e transfectados por 24 horas em células HEK ou HeLa em condições normais de cultura celular. Extratos celulares foram avaliados através de deglicosilação enzimática, western blotting, imunofluorescência e microscopia confocal, e atividade enzimática residual. Etapa 2 - estudo transversal com amostragem por conveniência, no qual foi obtida amostra de DNA genômico ou RNA total de 18 pacientes não relacionados com ML II (n=10) ou III (n=8). O gene GNPTAB foi analisado através de sequenciamento de Sanger (n=17) e sequenciamento de nova geração (n=1). As variantes do tipo troca de sentido, ainda não descritas na literatura, foram pesquisadas em 200 alelos controles brasileiros. Etapa 3 - estudo retrospectivo que incluiu 32 pacientes brasileiros não relacionados (consanguinidade, n=6/32) com diagnóstico clínico 9 e genético de ML II/III alfa/beta. A frequência regional dos alelos alterados foi determinada. Resultados: Etapa 1 – as variantes p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr e p.Arg986Cys são expressas, transportadas e clivadas por S1P de maneira comparável à proteína selvagem, contudo todos os mutantes apresentam atividade residual inferior a 5%. Já a proteína mutante p.Asp76Gly é modificada com estruturas de glicosilação, permanece retida no retículo endoplasmático e, por consequência, possui atividade residual indetectável. Etapa 2 - O genótipo foi determinado em 18 pacientes (ML II= 10, III alfa/beta= 8). Um total de 16 diferentes variantes foram encontradas, sendo nove ainda não descritas na literatura: r.86_116conNM_024312.5:19_49, c.227A>G, c.831delT, c.1154C>T, c.1763insA, c.1927delAATT, c.2034dup, c.2720_2721del e c.3333T>G. Somente as variantes c.3503_3504del (n=10/31), c.1208T>C(n=4/31), c.242G>T (n=3/31) e c.2249dup (n=2/31 alelos) foram recorrentes. Etapa 3 - Os pacientes eram originários de todas as regiões do Brasil (Sudeste n=14, Nordeste n=10, Sul n=4, Centro-oeste n=3, Norte n=1), sendo 6/32 consanguíneos. As variantes mais prevalentes foram a c.3503_3504del (n= 19, Nordeste n=9, Sudeste n=4, Centro-oeste n=4, Sul n=2), associada à forma grave da doença, e a c.1208T>C (n= 6, Nordeste n=3, Sudeste n=2, Centro-oeste n=1), associada à forma mais branda. A variante c.3503_3504del é a mais frequentemente encontrada nas regiões Centro-oeste, Nordeste e Sudeste do Brasil, enquanto a c.1196C>T é identificada em 42,8% dos alelos da região Sul. Conclusões: a caracterização do impacto funcional de variantes do tipo troca de sentido permitem concluir que os resíduos p.Glu389, p.Asp408, p.His956 e p.Arg986 são importantes para a função da catalítica da GlcNAc-1-fosfotransferase, enquanto que o aminoácido p.Asp76 pode estar envolvido no transporte da enzima ao complexo de Golgi. A análise genética dos pacientes brasileiros com ML II e III confirma a alta heterogeneidade genética e a alta frequência de variantes patogênicas privadas do gene GNPTAB, além de reiterar a variante c.3503_3504del como a predominantemente identificada nessa população. Sob a perspectiva de todos os pacientes diagnosticados com ML II/III no Brasil, é possível concluir que diferentes regiões apresentam frequências alélicas de variantes patogênicas específicas, o que pode ser explicado através da ocorrência de efeito fundador ou altas taxas de consanguinidade, ou uma combinação de ambas.

Lysosomal hydrolases are peptides synthesized in ribosomes attached to the membrane, and concomitantly incorporated to the lumen of the endoplasmic reticulum. Still in this organelle, these proteins are modified with standard oligosaccharides in asparagine residues contained in their primary structure. The generation of mannose-6-phosphate (M6P) residues in the oligosaccharides present in lysosomal hydrolases guarantees the direction of these to the lysosomal compartments. The first stage of M6P generation is performed by GlcNAc-1-phosphotransferase, which is resident in the cis portion of the Golgi complex, and performs the recognition of the hydrolases and the transfer of a residue of GlcNAc-1-phosphate from the UDP-GlcNAc donor to the mannose residue in position 6 of the oligosaccharide present in the hydrolase. GlcNAc-1-phosphatetransferase is a hexameric complex formed by two subunits α, β and γ (α²β²γ²), where the first two are encoded by the GNPTAB gene and the third by the GNPTG gene. Pathogenic variants identified in the GNPTAB gene cause rare lysosomal diseases Mucolipidosis (ML) II and III alpha/beta, and variants in GNPTG cause the ML III gamma. These diseases are severe and characterized by an overflow of lysosomal hydrolases into the extracellular environment and, consequently, their absence in lysosomal compartments, which causes an accumulation of non-degraded macromolecules. Objectives: 1) To characterize pathophysiological mechanisms of GNPTAB pathogenic variants; 2) To characterize Brazilian patients with ML II and III alpha/beta in relation to GNPTAB pathogenic variants. Methodology: Section 1 - in vitro study, in which constructs containing the variants p.Asp76Gly, p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr, p.Arg986Cys and p.Leu1168Glnfs*5 of the GNPTAB gene were generated by site-directed mutagenesis, and transfected for 24 hours in HEK or HeLa cells under normal cell culture conditions. Cell extracts were evaluated by enzymatic deglycosylation, western blotting, immunofluorescence and confocal microscopy, and residual enzymatic activity. Section 2 - cross-sectional study with convenience sampling, in which a sample of genomic DNA or total RNA was obtained from 18 patients unrelated ML II (n=10) or III alpha/beta (n=8). The GNPTAB gene was analyzed through Sanger sequencing (n=17) and new generation sequencing (n=1). Missense variants not described in the literature were researched in 200 Brazilian control alleles. Section 3 - retrospective study that included 32 unrelated Brazilian patients (consanguinity, n=6/32) with clinical and genetic diagnosis of ML II/III alpha/beta. The regional frequency of the altered alleles was determined. Results: 11 Section 1 - the variants p.Ser385Leu, p.Glu389Lys, p.Asp408Asn, p.His956Tyr and p.Arg986Cys are expressed, transported and cleaved by S1P as the wildtype protein, however all mutants present residual activity lower than 5%. The p.Asp76Gly mutant is modified with glycosylation structures, remains retained in the endoplasmic reticulum and, consequently, has undetectable residual activity. Section 2 - The genotype was determined in 18 patients (ML II= 10, III alpha/beta= 8). A total of 16 different variants were found, nine of which have not yet been described in the literature: r.86_116conNM_024312.5:19_49, c.227A>G, c.831delT, c.1154C>T, c.1763insA, c.1927delAATT, c.2034dup, c.2720_2721del and c.3333T>G. Only variants c.3503_3504del (n=10/31), c.1208T>C (n=4/31), c.242G>T (n=3/31) and c.2249dup (n=2/31 alleles) were recurrent. Section 3 - The patients were from all regions of Brazil (Southeast n=14, Northeast n=10, South n=4, Midwest n=3, North n=1), with 6/32 being consanguineous. The most prevalent variants were c.3503_3504del (n=19, Northeast n=9, Southeast n=4, Midwest n=4, South n=2), associated with the severe form of the disease, and c.1208T>C (n=6, Northeast n=3, Southeast n=2, Midwest n=1), associated with the milder form. Variant c.3503_3504del is the most frequently found in the Midwest, Northeast, and Southeast regions of Brazil, while c.1196C>T is identified in 42.8% of the alleles in the South. Conclusions: The characterization of the functional impact of missense variants allows the conclusion that the p.Glu389, p.Asp408, p.His956 and p.Arg986 residues are important for the catalytic function of GlcNAc-1-phosphotransferase, while the amino acid p.Asp76 may be involved in the transport of the enzyme to the Golgi complex. The genetic analysis of Brazilian patients with ML II and III alpha/beta confirms the high genetic heterogeneity and the high frequency of individual pathogenic variants of the GNPTAB gene, and reiterates the variant c.3503_3504del as the predominant one identified in this population. From the perspective of all patients diagnosed with ML II/III in Brazil, it is possible to conclude that different regions present allelic frequencies of specific pathogenic variants, which can be explained by the occurrence of a founding effect or high inbreeding rates, or a combination of both.