Avaliação da HMG-CoA-redutase como alvo para o reposicionamento de fármacos como novos anti-helmínticos

Abstract

Cestódeos são vermes parasitas capazes de infectar uma grande variedade de mamíferos, incluindo os seres humanos. Facilmente transmitidos entre hospedeiros, causam doenças (cestodíases) de relevância médica e veterinária, como as equinococoses (causadas pela fase larval de Echinococcus spp.) e as cisticercoses (causadas pela fase larval de Taenia solium). O tratamento de cestodíases viscerais como estas geralmente se baseia no uso de benzimidazóis e praziquantel, que não são eficazes contra infecções causadas por cestódeos em seus estágios larvais. Portanto, novos antihelmínticos mais eficazes são necessários para o tratamento de cestodíases viscerais. Nesse contexto, o reposicionamento de fármacos é uma estratégia atraente. Em cestódeos e outros helmintos, a via do mevalonato é essencial devido à sua importância em processos como ubiquitinação, prenilação e a glicolisação de proteínas. Assim, enzimas desta via têm sido propostas como alvos potenciais para o desenvolvimento de novos anti-helmínticos. Neste trabalho, o potencial da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril Coenzima A (HMG-CoA) redutase (enzima central da via do mevalonato) como alvo terapêutico em cestódeos está sendo avaliado juntamente com o reposicionamento de estatinas inibidoras da HMG-CoA-redutase (atualmente usadas para tratar a hipercolesterolemia em humanos) como novos anti-helmínticos. Para a identificação e definição das sequências de aminoácidos de proteínas ortólogas da HMG-CoA-redutase em platelmintos, nematódeos e seus respectivos hospedeiros, as sequências de aminoácidos de proteínas ortólogas da HMG-CoA-redutase de bancos de dados públicos foram recuperadas e alinhadas. Um total de 101 sequências de aminoácidos de proteínas ortólogas de HMG-CoA-redutase foram recuperadas (72 do banco de dados HMMER e 29 do banco de dados WormBase ParaSite). O tamanho médio das sequências de aminoácidos foi de 792 aa (375-1200 aa) e a identidade média dessas sequências de aminoácidos com a enzima ortóloga humana (888 aa) foi de 37% (20-95%), com maior conservação no domínio catalítico (587-1102 aa) da enzima. Já foi demonstrado em diferentes organismos que a sequência de aminoácidos do domínio catalítico da HMG-CoA-redutase é altamente conservada em eucariotos, mas o domínio âncora de membrana é pouco conservado. Para avaliar o grau de conservação evolutiva da HMG-CoA-redutase entre os platelmintos, nematódeos e seus respectivos hospedeiros, foi realizada uma análise filogenética. Na árvore resultante, os cordados, platelmintos e nematódeos foram separados em três clados distintos. Além disso, os platelmintos foram divididos em dois grupos monofiléticos de vermes parasitas, um correspondente aos trematódeos e outro aos cestódeos. Esses resultados são indicativos de conservação entre os grupos analisados. Para analisar as possíveis formas de interação entre HMGCoA-redutase de Mesocestoides corti (McosHMGCR), Echinococcus multilocularis (EmHMGCR), Echinococcus granulosus (EgHMGCR) e Taenia solium (TsHMGCR) e as estatinas, foi realizada a predição da estrutura tridimensional da enzima destes parasitos por modelagem comparativa. A estrutura geral de McosHMGCR, EmHMGCR, EgHMGCR e TsHMGCR foi preservada em comparação com a estrutura da enzima ortóloga humana. Além disso, realizamos docking molecular dessas estruturas com as estatinas inibidoras (sinvastatina e fluvastatina). Observamos que em todas as estruturas dos parasitos, os resíduos Arg, Ser, Lys e Glu em posições conservadas do sítio ativo interagem com a sinvastatina ou fluvastatina. Esses resíduos presentes em McosHMGCR, EmHMGCR, EgHMGCR e TsHMGCR que interagem com a sinvastatina ou fluvastatina também aparecem interagindo com os inibidores no cristal hHMGCR, o que reforça a hipótese de que as HMG-CoA-redutases dos cestódeos podem ser inibidas pelas estatinas e que esses efeitos inibitórios podem ser letais para as larvas de cestódeos. Estes resultados são indicativos da conservação dos resíduos de aminoácidos e da estrutura geral. Além disso, são necessárias análises adicionais, como a avaliação in vitro e in vivo dos possíveis efeitos da sinvastatina e da fluvastatina sobre larvas de M. corti. Realizar ensaios in vitro para confirmar a inibição da HMG-CoA-redutase de M. corti pela sinvastatina e pela fluvastatina e identificar os mecanismos de ação da sinvastatina e da fluvastatina sobre tetratirídeos de M. corti.

Cestodes are parasitic flatworms capable of infecting a wide variety of mammals, including humans. Easily transmitted between hosts, they cause diseases (cestodiasis) of medical and veterinary relevance, such as echinococcosis (caused by the larval stage of Echinococcus spp.) and cysticercosis (caused by the larval stage of Taenia solium). The treatment of visceral cestodiases usually relies on benzimidazoles and praziquantel, which are not effective against infections caused by cestodes in their larval stages. Therefore, new and more effective anthelmintics are necessary for the treatment of visceral cestodiases. In this context, drug repositioning is an appealing strategy. In cestodes and other helminths, the mevalonate pathway is essential due to its importance in processes such as ubiquitination, prenylation, and protein glycosylation. So, enzymes from this pathway have been proposed as potential targets for the development of new anthelmintics. In this work, the potential of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl Coenzyme A (HMG-CoA) reductase (the central enzyme of the mevalonate pathway) as a therapeutic target in cestodes is being assessed along with of HMG-CoA reductase inhibiting statins (currently used to treat hypercholesterolemia in humans) as novel anthelmintics. For the identification and definition of HMG-CoA reductase orthologues in flatworms, nematodes, and their respective hosts, orthologous HMG-CoA reductase amino acid sequences from public databases were retrieved and aligned. A total of 101 orthologous HMG-CoA reductase amino acid sequences were recovered (72 from the HMMMER database and 29 from the WormBase ParaSite database). The average length of the amino acid sequences was 792 aa (375-1200 aa) and the average identity of these amino acid sequences with the human orthologous enzyme (888 aa) was 37% (20-95%), with greater conservation in the domain catalytic (587-1102 aa) of the enzyme. It has already been shown in different organisms that the amino acid sequence of the catalytic domain of HMG-CoA reductase is highly conserved in eukaryotes, but the membrane anchor domain is poorly conserved. To assess the degree of evolutionary conservation of HMG-CoA reductase among flatworms, nematodes, and their respective hosts, a phylogenetic analysis was performed. In the resulting tree, chordates, flatworms, and nematodes were separated into three distinct clades. In addition, flatworms were divided into two monophyletic groups of parasitic worms, one corresponding to trematodes and the other to cestodes. These results are indicative of conservation among the groups analyzed. To analyze the possible forms of interaction between HMG-CoA reductase from Mesocestoides corti (McosHMGCR), Echinococcus multilocularis (EmHMGCR), Echinococcus granulosus (EgHMGCR), and Taenia solium (TsHMGCR) and statins, the prediction of the three-dimensional structure of the enzyme were performed of these parasites by comparative modeling. The general structure of McosHMGCR, EmHMGCR, EgHMGCR, and TsHMGCR was preserved compared to the structure of the human orthologous enzyme. In addition, we performed molecular docking of these structures with inhibitory statins (simvastatin and fluvastatin). We observed that in all the structures of the parasites, the residues Arg, Ser, Lys, and Glu in conserved positions of the active site interact with simvastatin or fluvastatin. These residues present in McosHMGCR, EmHMGCR, EgHMGCR, and TsHMGCR that interact with simvastatin or fluvastatin also appear to interact with the inhibitors in the hHMGCR crystal, which reinforces the hypothesis that HMG-CoA reductases of cestodes can be inhibited by statins and that these inhibitory effects can be lethal to cestode larvae. These results are indicative of the conservation of amino acid residues and general structure. Furthermore, additional analyzes are needed, such as the in vitro and in vivo evaluation of the possible effects of simvastatin and fluvastatin on M. corti tetrathyridia. Carry out in vitro assays to confirm the inhibition of M. corti HMG-CoA reductase by simvastatin and fluvastatin and to identify the mechanisms of action of simvastatin and fluvastatin on M. corti tetrathyridia.