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Expressão e purificação de fragmentos da Glicogênio Sintase Quinase de Rhipicephalus microplus

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Expressão e purificação de fragmentos da Glicogênio Sintase Quinase de Rhipicephalus microplus

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Título Expressão e purificação de fragmentos da Glicogênio Sintase Quinase de Rhipicephalus microplus
Autor Schuler, Aline Domingues
Orientador Vaz Junior, Itabajara da Silva
Data 2010
Nível Graduação
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Biociências. Curso de Ciências Biológicas: Ênfase Molecular, Celular e Funcional: Bacharelado.
Assunto Glicogenio sintase cinase-3 (GSK)
Rhipicephalus microplus
[en] Control method
[en] GSK
[en] Rhipicephalus microplus
Resumo O carrapato Rhipicephalus microplus é um ectoparasita responsável por perdas econômicas importantes na pecuária bovina. A utilização de acaricidas é o método mais frequente no combate a este ectoparasita, entretanto, a pesquisa em torno do desenvolvimento de uma vacina contra este parasita é crescente, com resultados que mostram que este pode ser um método de controle eficiente. Baseados nisto, diversas proteínas envolvidas no desenvolvimento do carrapato estão sendo caracterizadas, incluindo a Glicogênio Sintase Quinase (GSK). A GSK é uma serina/treonina quinase envolvida na síntese do glicogênio, o maior estoque de glicose em células animais. Resultados prévios mostraram que o tratamento de carrapatos adultos com um inibidor específico para GSK (alsterpaullone) causa redução significante no número e na fertilidade dos ovos. Assim o estudo da GSK de R. microplus pode contribuir para o desenvolvimento de uma vacina para proteção imunológica contra o carrapato. Visando estudar essa enzima a nível molecular, o gene que codifica essa proteína foi subclonado em 2 fragmentos para a obtenção de proteínas recombinantes referentes as porções N-terminal e C-terminal da GSK. Para a clonagem, amplicons obtidos por PCR foram hidrolisados e ligados ao vetor de expressão. A clonagem foi confirmada por hidrólise, PCR e sequenciamento de DNA. Escherichia coli BL21(DE3) C41 foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente à porção N-terminal da proteína (N-GSKr) e E. coli BL21(DE3) RP foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente a porção C-terminal (C-GSKr). As condições ideais para a expressão protéica foram estipuladas a partir do teste de diferentes condições de temperatura e período de incubação das culturas. As expressões foram analisadas por eletroforese SDS-PAGE 12% e a presença das proteínas recombinantes foram confirmadas por western blot com anticorpo monoclonal anti-histidina e a purificação C-GSKr realizada por cromatografia de afinidade a Ni+2. Foi obtido um soro de coelho anti-C-GSKr, comprovando sua capacidade de induzir resposta imune. Em estudos futuros este soro será usado em western blot para identificar a presença de GSK em tecidos de carrapato.
Abstract A clonagem foi confirmada por hidrólise, PCR e sequenciamento de DNA. Escherichia coli BL21(DE3) C41 foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente à porção N-terminal da proteína (N-GSKr) e E. coli BL21(DE3) RP foi transformada para a obtenção do fragmento protéico recombinante referente a porção C-terminal (C-GSKr). As condições ideais para a expressão protéica foram estipuladas a partir do teste de diferentes condições de temperatura e período de incubação das culturas. As expressões foram analisadas por eletroforese SDS-PAGE 12% e a presença das proteínas recombinantes foram confirmadas por western blot com anticorpo monoclonal anti-histidina e a purificação C-GSKr realizada por cromatografia de afinidade a Ni+2. Foi obtido um soro de coelho anti-C-GSKr, comprovando sua capacidade de induzir resposta imune. Em estudos futuros este soro será usado em western blot para identificar a presença de GSK em tecidos de carrapato. Escherichia coli BL21(DE3) C41 were transformed with the plasmid N-GSK/pAE and E. coli BL21(DE3) RP were transformed with the plasmid C-GSK/pAE for expression of recombinant proteins. Optimal production was achieved by testing different growth temperatures, period of cultivation. The expressions were analyzed by electrophoresis SDS-PAGE 12% and the presence of the recombinant proteins were confirmed by western blot, using monoclonal antibody anti-histidine. The purification of the C-GSK protein fragment has been done by Ni2+ affinity chromatography. The immunization of rabbits with C-GSKr had shown its capacity to induce an immune response. A western blot with this serum showed the presence of antibodies that recognize C-GSKr. In future works this serum will be used to indentify GSK in tick tissues.
Tipo Trabalho de conclusão de graduação
URI http://hdl.handle.net/10183/26150
Arquivos Descrição Formato
000756457.pdf (498.3Kb) Texto completo Adobe PDF Visualizar/abrir

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