In vitro and in vivo survival of mouse morulas and blastocysts following vitrification in 45% glycerol

Abstract

A toxidez do agente crioprotetor é um dos aspectos mais críticos no sucesso da vitrificação de embriões mamíferos, variando conforme a concentração, o tempo e a temperatura de exposição. Além disto, embriões de diferentes espécies ou estádios de desenvolvimento podem tolerar diferentes níveis de exposição a agentes crioprotetores. Este estudo visou avaliar a sobrevivência in vitro e in vivo de embriões Mus musculus após a vitrificação em diferentes concentrações e tempos de exposição ao crioprotetor previamente à vitrificação. No Experimento 1, mórulas compactas, blastocistos e blastocistos expandidos foram expostos a 10% de glicerol por 10 min (grupo 1) ou 25% de glicerol por 10, 5 ou 2,5 min (grupos 2, 3 e 4) previamente à exposição à solução de vitrificação contendo 45% de glicerol por 1 min, a 20°C, antes da imersão em nitrogênio líquido. A descongelação ocorreu em banhomaria a 20°C por 20 seg, e a diluição do crioprotetor foi realizada em 1 M de sacarose por 10 min. Após cultivo in vitro por 1 e 48 h, os embriões foram avaliados morfologicamente. A sobrevivência in vitro de mórulas compactas e blastocistos não foi afetada pelas concentrações e tempos de equilíbrio em glicerol previamente à vitrificação. No entanto, houve uma menor viabilidade embrionária após a vitrificação de blastocistos expandidos. No Experimento 2, mórulas compactas e blastocistos frescos e vitrificados (conforme o grupo 1, do Experimento 1) foram transferidos para receptoras após cultivo in vitro de 1 h. As taxas de prenhez, baseadas na proporção de fetos viáveis, foram semelhantes entre mórulas compactas vitrificadas e frescas (27 vs. 33%, respectivamente). Entretanto, os blastocistos vitrificados mostraram uma sobrevivência in vivo menor que os controles (9% vs. 52%, respectivamente).

The toxicity of cryoprotectant agents is one of the critical factors for the successful vitrification of mammalian embryos, which depends on the concentration, time and temperature of exposure to the cryoprotectant. Moreover, embryos from different species or stages of development have distinct levels of tolerance to cryoprotectant agents. This study aimed to evaluate the in vitro and in vivo survivals of mouse embryos after distinct times of exposure to two cryoprotectant concentrations prior to vitrification. In Experiment 1, compact morulas, blastocysts and expanded blastocysts were exposed to 10% glycerol for 10 min (group 1) or to 25% glycerol for 10, 5 and 2.5 min (groups 2, 3, and 4, respectively) prior to their exposure to the vitrification solution containing 45% glycerol for 1 min at 20°C before immersion in liquid nitrogen. Embryos were thawed in a water bath at 20°C for 20 sec, and the cryoprotectant was diluted in 1 M sucrose for 10 min. Then, embryos were morphologically evaluated following in vitro culture for 1 and 48 h. In vitro survivals of compact morulas and blastocysts were not affected by glycerol concentration and/or equilibration time prior to vitrification. However, expanded blastocysts demonstrated a lower survivability to vitrification. In Experiment 2, fresh and vitrified (according to procedures in group 1, Experiment 1) compact morulas and blastocysts were transferred to recipients following in vitro culture for 1 h at room temperature. Pregnancy rates, based on the proportion of viable fetuses, were similar between vitrified and fresh compact morulas (27% and 33%, respectively). However, vitrified blastocysts demonstrated a lower in vivo survival than controls (9% vs. 52%, respectively).