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Estudo da ação estimulatória de andrógenos sobre o transporte de cálcio e a secreção de insulina em célula beta de pâncreas de rato

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Estudo da ação estimulatória de andrógenos sobre o transporte de cálcio e a secreção de insulina em célula beta de pâncreas de rato

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Título Estudo da ação estimulatória de andrógenos sobre o transporte de cálcio e a secreção de insulina em célula beta de pâncreas de rato
Autor Grillo, Marcelo de Lacerda
Orientador Silva, Roselis Silveira Martins da
Co-orientador Wassermann, Guillermo Federico
Data 2011
Nível Doutorado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Fisiologia.
Assunto Androgênios
Cálcio
Canais de cálcio
Ilhotas pancreáticas
Insulina
Nandrolona
Testosterona
Resumo Em homens, os níveis de testosterona e de testosterona biodisponível (livre e a ligada à albumina) declinam com a idade, apresentando elevado risco de desenvolver resistência à insulina e diabetes tipo II. Já foi demonstrada a ação clássica (efeito genômico) da testosterona sobre a síntese e a liberação de insulina em pâncreas de rato. Os objetivos do presente trabalho são determinar: 1) a ação não clássica específica da testosterona, da nandrolona e de outros esteróides sexuais sobre a secreção de insulina em ilhotas pancreáticas isoladas de ratos machos adultos; 2) a influência de aminoácidos sobre esta ação; 3) a ação da testosterona sobre o transporte de aminoácidos; 4) a participação dos canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L e dos canais KATP na ação da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2+; 5) a participação da via da fosfolipase C na ação da testosterona sobre a captação de 45Ca2+. As ilhotas foram isoladas de pâncreas de 3 ratos Wistar machos (pesando 180-220g) por experimento pela técnica de Lacy e Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). Nos experimentos de secreção de insulina, amostras de 10μL de ilhotas isoladas foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 3 minutos em presença ou não de testosterona (1μM), T-BSA (1μM), nandrolona (1μM), 17 -estradiol (10 nM) ou progesterona (1μM) em um incubador metabólico Dubnoff em tampão KRb-HEPES com glicose 3 mM a 37ºC, pH 7,4 e gaseificação constante com carbogênio (O2:CO2; 95:5; v/v). Nos experimentos com glutamina, lisina, alanina e leucina, as ilhotas eram incubadas por mais 3 minutos com estes aminoácidos. A incubação foi interrompida em banho de gelo. Os tubos com as ilhotas eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante coletado e a insulina quantificada por radioimunoensaio. No experimento de captação de aminoácido, as ilhotas isoladas (10μL) foram pré-incubadas por 30 minutos e incubadas por 15, 30 ou 60 minutos com 0,2 μCi de [1-14C] ácido a-metil aminoisobutírico mais testosterona (1μM). Após o final da incubação os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G. O sobrenadante (meio externo) era preservado. As ilhotas era transferidas para tubos Eppendorff contendo 1 mL de água destilada (meio interno). Os tubos com as ilhotas eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 100 μL de cada frasco e do respectivo meio externo para contagem da radioatividade. Os resultados foram expressos pela relação entre a radioatividade contida no tecido (meio interno) e no meio de incubação (meio externo). Nos experimentos de captação de 45Ca 2+, as ilhotas isoladas (50μL) eram pré-incubadas por 45 ou 50 minutos com 0,2 μCi 45Ca2+, novamente pré-incubadas por 10 minutos com nifedipina (1μM), diazoxida (100μM), glibenclamida (25μM), ou tolbutamida (10μM) e incubadas com ou sem testosterona (0,1μM) ou nandrolona (0,1μM) por 1 minuto. No experimento com U73122 (2μM), as ilhotas eram pré-incubadas por mais 15 minutos com este fármaco e incubadas com ou sem testosterona (1μM) por 1 minuto. Para a interrupção da incubação, utilizou-se 1 mL de tampão frio com cloreto de lantânio (10 mM) Após, os tubos eram centrifugados por 2 minutos a 45 x G, o sobrenadante desprezado e as ilhotas lavadas duas vezes com a solução de cloreto de lantânio. As ilhotas eram transferidas para tubos tipo Eppendorff contendo 1 mL de água destilada. Os tubos eram congelados por 24 horas e após sonicados por 30 segundos. Eram retiradas amostras de 50 μL de cada frasco para contagem da radioatividade. A testosterona e a nandrolona estimularam a secreção de insulina após incubação de 3 minutos, através do fechamento de canais K+ ATP tendo, como conseqüência, o aumento da captação de Ca2+ e a exocitose do hormônio. A testosterona ligada à albumina, que não entra na célula e interage com receptor de membrana, também estimulou a secreção de insulina em 3 minutos, sugerindo um efeito de membrana dos andrógenos. Em nossas condições experimentais, o 17- -estradiol e a progesterona não mostraram efeito sobre a secreção de insulina. A ação androgênica sobre a secreção de insulina ocorreu somente na ausência de glicose ou em concentrações sublimiares (3mM). A testosterona não estimulou a captação do aminoácido metilaminoisobutírico [14C]. A L-alanina estimulou a secreção de insulina. Porém, quando associadas testosterona e alanina somente, houve redução na secreção. Também foi observado que uma mistura de aminoácidos (MIX- glutamina, lisina, leucina e alanina,) em diferentes concentrações proporcionais foi efetiva na secreção de insulina. Houve aumento significativo na secreção de insulina quando associados testosterona e a concentração 2x maior dos aminoácidos. Também, os andrógenos aumentaram a captação de Ca2+ em 60 segundos. A ação da testosterona sobre a captação de Ca2+ ocorreu em concentrações limiares de glicose (5 e 8 mM), porém não em concentrações elevadas (11 mM). Quando a testosterona foi incubada na presença de nifedipina (bloqueador de canais de Ca2+ dependentes de voltagem do tipo L), seu efeito estimulatório sobre a captação de 45Ca2+ foi anulado. Ocorreu inibição da ação androgênica quando a testosterona foi incubada em presença de diazoxida, a qual aumenta a probabilidade de abertura do canal K+ ATP. O efeito da testosterona e da nandrolona sobre a captação de 45Ca2 é análogo à ação das sulfoniluréias (glibenclamida e tolbutamida), as quais inibem o canal K+ ATP. Ambos os efeitos indicam que a ação da testosterona envolve o fechamento do canal K+ ATP e conseqüente despolarização da membrana da célula . O inibidor da fosfolipase C, o U73122, bloqueou a ação estimulatória de testosterona sobre a captação de 45Ca2+. Nossa conclusão para estes achados seria que a testosterona e a nandrolona, na presença de baixas concentrações de substratos energéticos como a glicose e aminoácidos, estimulariam a liberação da insulina para modular os efeitos catabólicos dos contra-reguladores e, assim, manter a homeostase. O mecanismo de secreção da insulina pelos andrógenos envolve a ativação de PLC via ligação ao receptor de membrana acoplado à proteína Gq, o fechamento de K+ ATP e a entrada de Ca2+ através de canais de cálcio dependentes de voltagem do tipo L.
Abstract In men, testosterone and bioavailable testosterone levels ( free and and albumin-bound) decline with age, with high risk of developing insulin resistance and type 2 diabetes. It has been already shown the classic action of testosterone (genomic effect) on the insulin synthesis and release in rat pancreas. The objective of this survey is to determine: 1) the specific non-classical action of testosterone, nandrolone and other sex steroids on insulin secretion in isolated pancreatic islets from adult male rats; 2) aminoacids influence on this action; 3) testosterone action on amino acid transport; 4) the participation of L-type voltagegated Ca2+ channels and KATP channels in the testosterone and nandrolone action on the 45Ca2+ uptake; 5) the participation of phospholipase C via in the testosterone action on the 45Ca2+ uptake. The islets were isolated from the pancreas of 3 male Wistar rats (weighing between 180 and 200g) per experiment by the technique of Lacy and Kostianovsky (Diabetes, 16:35-39, 1967). In the experiments of insulin secretion, samples of 10μL of isolated islets were preincubated for 30 minutes and incubated for 3 minutes in the presence or absence of testosterone (1μM), T-BSA (1μM), nandrolone (1μM), 17 -estradiol (10 nM) or progesterone (1μM) in a Dubnoff metabolic incubator in KRb-HEPES buffer with 3 mM glucose at 37ºC, pH 7,4 and constant gasification constante with carbogen (O2:CO2; 95:5; v/v). In experiments with glutamine, lysine, alanine and leucine, the islets were incubated for another 3 minutes with these amino acids. The incubation was stopped in an ice bath. The tubes containing the islets were centrifuged for 2 minutes at 45xG, the supernatant collected and insulin measured by radioimmunoassay. In the experiment of amino acid uptake, isolated islets (10μL) were pre-incubated for 30 minutes and incubated for 15, 30 or 60 minutes with 0,2 μCi of [1-14C] a-metyl aminoisobutyric plus testosterone (1μM). After the end of incubation, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G. The supernatant (environment) was preserved. The islets were transferred to Eppendorff tubes containing 1mL of distilled water (internal environment). The tubes with islets were frozen for 24 hours and after this sonicated for 30 seconds. Samples of 100 μL were removed from each bottle and respective environment for radioactivity counting. Results were expressed by the relation between the radioactivity contained in the tissue (internal environment) and the incubation environment (external environment) . In the experiments of 45Ca 2+ uptake, the isolated islets (50μL) , were pre-incubated for 45 or 50 minutes with 0,2 μCi 45Ca2+, preincubated again for 10 minutes with nifedipine (1μM), diazoxide (100μM), glibenclamide (25μM), or tolbutamide (10μM) and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. In this experiment with U73122 (2μM), the islets were pre-incubated for more 15 minutes with this drug and incubated with or without testosterone (1μM) for 1 minute. For the interruption of incubation, it was used a cold 1mL buffer with lanthanum chloride (10mM). After, tubes were centrifuged for 2 minutes at 45 x G, the supernatant discarded and the islets washed twice with lanthanum chloride solution. The islets were transferred to Eppendorf tubes containing 1ml of distilled water. The tubes were frozen for 24 hours and after it, sonicated for 30 seconds. Samples of 50 μL were taken from each bottle for radioactivity counting. In isolated pancreatic islets of rats, testosterone and nandrolone have stimulated insulin secretion, after a 3-minute incubation period, closing the K+ ATP channels, having as consequence the increase of Ca2+ inflow and the hormone exocytosis. Testosterone conjugated to bovine serum albumin, which is not membrane permeable and interacts with the receptor of membrane, also stimulated insulin secretion in 3 minutes, suggesting an androgen membrane effect. In our experimental conditions, 17- -estradiol and progesterone have not demonstrated effects in insulin secretion. Testosterone has not stimulated the uptake of methylaminoisobutyric acid [1-14C]. L-alanine has stimulated insulin secretion. However, when testosterone was associated only with alanine, insulin secretion has decreased. It has also been noted that an aminoacid mixture (MIX-alanine, glutamine, lysine and leucine) in different proportional concentrations has been effective in insulin secretion. When associated, testosterone and MIX, there has been an increase in insulin secretion when the concentration of amino acids has been 2 times higher. Also, the androgens have increased the 45Ca2+ uptake in 60 seconds. However, the androgenic action has occurred only in absence of glucose or at sub stimulatory concentrations (3 mM). The action of testosterone on 45Ca2+ uptake has occurred at stimulatory glucose concentrations (5 and 8 mM), but not in high concentrations (11 mM). When testosterone has been incubated in the presence of nifedipine (Ca2+ type L channel blocker), its stimulatory effect on 45Ca2+ uptake has been nullified. When it was used diazoxide to produce the opening of K+ ATP channels, it has occurred the inhibition of androgenic action. The testosterone and nandrolone effect is analogous to the action of sulphonilureias (glibenclamida and tolbutamida), which inhibit the K+ ATP channel. Both effects show that testosterone action involves the K+ ATP channel closing and consequent membrane depolarization of cell. The presence of U73122, which inhibits the activation of PLC, has inhibited the testosterone action on 45Ca2+ uptake. Our conclusion for these results would be that testosterone and nandrolone, in the presence of low concentrations of energetics substrates as glucose and amino acids would stimulate the insulin liberation for modulating the catabolic effects of counter-regulators and, then, sustaining homeostasis. It can also be observed that the associated mechanism involves a Gq protein-coupled membrane receptor-binding, the PLC activation, the K+ ATP closing and Ca2+ entry through the voltage-dependent L-type calcium channels.
Tipo Tese
URI http://hdl.handle.net/10183/31704
Arquivos Descrição Formato
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