Diagnóstico de Mycoplasma hyopneumoniae por reação em cadeia da polimerase em três diferentes métodos de conservação de amostras

Abstract

Mycoplasma hyopneumoniae é um importante patógeno que causa pneumonia, perda de peso e condenação de carcaças no abatedouro. O diagnóstico de infecção por M. hyopneumoniae é frequentemente feito através de histopatologia, imuno-histoquímica (IHQ) e reação em cadeia da polimerase (PCR), ou uma combinação dessas técnicas. Para exame histológico, amostras são conservadas em solução de formalina a 10%. PCR pode ser realizada a partir de amostras submetidas a vários métodos de conservação, incluindo suabes, tecido refrigerado ou congelado, ou ainda tecido fixado em formalina e embebido em parafina (FFEP). Entretanto, o processo de fixação em formalina pode inibir a amplificação de DNA. Para avaliar os diferentes métodos de conservação para a detecção de M. hyopneumoniae, 15 pulmões com lesões de consolidação crânio-ventral de suínos oriundos de rebanhos com problemas respiratórios foram selecionados no abatedouro. Suabes bronquiais e pulmão fresco foram colhidos, e um fragmento da mesma porção de pulmão foi colocado por 48 horas em solução de formalina tamponada. Nested PCR e PCR em Tempo Real foram realizados comparando amostras de tecido FFEP e amostras refrigeradas (suabe bronquial e tecido). O exame histopatológico dos pulmões revelou características de infecção por M. hyopneumoniae em 12 casos. Detecção de M. hyopneumoniae por nested PCR ocorreu em todas as amostras de suabe e tecido não fixado. Já em amostras FFEP, o agente foi detectado somente em 11 amostras. Os resultados de PCR em Tempo Real foram todos positivos para amostras de suabe e de tecido não fixado, enquanto todas as amostras FFEP foram positivas para o agente. Ao relacionar os resultados com achados histológicos, 8 de 9 animais com score de lesão 3 apresentaram resultado do nested PCR positivo. Resultados de PCR em Tempo Real com valor de Cicle threshold (Ct) entre 24,1 e 33,3 tiveram caraterísticas mais compatíveis com infecção por M. hyopneumoniae. PCR em Tempo Real foi a técnica que melhor detectou material genético de M.hyopneumoniae a partir de amostras FFEP. Esta comparação demonstrou que é possível detectar M. hyopneumoniae a partir de amostras FFEP, porém a eficácia do teste fica comprometida sob essas condições. O estudo demonstrou que é possível detectar M. hyopneumoniae a partir de diferentes métodos de conservação, porém com variável eficácia.

Mycoplasma hyopneumoniae is an important pathogen that causes pneumonia, weight losses and carcass condemnation in swine. The diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae infection is often performed through histopathology, immunohistochemistry (IHC) and polymerase chain reaction (PCR), or a combination of these techniques. For histological examination, samples are conserved in a 10% formalin solution. PCR can be performed from samples under several methods of conservation, including swabs, frozen tissue or formalin fixed and paraffin embedded (FFPE) tissue. However, the formalin fixation process often inhibits DNA amplification. In order to evaluate whether M. hyopneumoniae DNA could be recovered from FFPE tissues, 15 lungs with cranioventral consolidation lesions from swine bred in herds with respiratory disease were selected in a slaughterhouse. Bronchial swabs and fresh lung tissue were collected, and a fragment of same lung portion was placed for 24h in neutral buffered formalin. Two different PCR assays were performed comparing samples of FFPE tissue with samples that were only refrigerated (bronchial swabs and tissue). Histopathological examination of the lungs revealed M. hyopneumoniae features in 12 cases. Nested PCR detection of Mycoplasma hyopneumoniae occurred in all 15 samples of swab and refrigerated tissue, while in FFPE tissue samples, M. hyopneumoniae was detected in only 11 of the 15 samples. Real time PCR results were all positive for swab and untreated tissue samples and FFPE samples. The results were related to histological findings, and 8 of the 9 lungs with score 3 lesions were nested PCR positive. Real-time PCR results from FFEP samples showed more consistent histological features of M. hyopneumoniae infection when the Ct value was between 24.1 and 33.3. Real-time PCR test was relatively the most sensitive technique. Comparison of different sample conservation methods indicates that it is possible to detect M. hyopneumoniae from FFPE tissue, but the efficiency of the PCR gets compromised under these conditions.