Análise da expressão de uma cromodomínio-helicase no parasito cestódeo Mesocestoides corti

Abstract

Mesocestoides corti é um platelminto endoparasita utilizado como modelo experimental para o estudo da classe cestoda, a qual abriga também os gêneros Echinococcus e Taenia, ambos de grande importância médica e veterinária. M. corti é considerado um cestódeo-modelo, pois, entre outras vantagens, pode ser mantido in vivo, em hospedeiros experimentais, e cultivado in vitro. Pouco ainda é sabido sobre os mecanismos moleculares envolvidos no processo de estrobilização de cestódeos. Assim, o objetivo geral deste trabalho é estudar uma cromodomínio-helicase diferencialmente expressa durante este processo em M. corti. Em estudos anteriores, nosso grupo construiu bibliotecas de cDNA enriquecidas com sequências diferencialmente expressas em larvas (tetratirídeos) e vermes segmentados e, delas, foram selecionadas para estudo sequências de cDNAs correspondentes a genes conservados relacionados ao desenvolvimento. Um dos cDNAs selecionados codifica parte de uma cromodomínio-helicase (McCHD), com ortólogos envolvidos em processos de remodelagem de cromatina e controle da expressão gênica em diferentes espécies eucarióticas. A sequência parcial da McCHD foi amplificada a partir de RNA de tetratirídeos por RT-PCR, clonada por recombinação in vivo em vetor modificado da série pGEX e expressa em Escherichia coli como proteína de fusão com a glutationa-Stransferase (GST). A proteína recombinante foi posteriormente purificada por cromatografia de afinidade em coluna de Glutathione Sepharose clivada com a protease TEV para liberação da GST e utilizada na imunização de um coelho. O antissoro policlonal monoespecífico assim produzido foi utilizado em experimentos de imunoblot para confirmar que o nível de expressão da McCHD é maior em tetratirídeos do que em vermes adultos. Experimentos de imunohistoquímica e de análise transcricional por RT-qPCR serão agora realizados para uma melhor caracterização do padrão de expressão espaçotemporal da McCHD ao longo do processo de desenvolvimento de M. corti.

Mesocestoides corti is a tapeworm of the Cestoda class, the same of species of medical and veterinary importance, such as those belonging to the genuses Echinococcus and Taenia. M. corti was chosen as model cestode organism, and due to the availability of established protocols for its maintenance both in vivo and in vitro. Little is known about the molecular mechanisms involved in cestode strobilization and this work aims to study a chromodomain-helicase differentially expressed during this process in M. corti. From previously studies was obtained cDNA sequence data from subtracted cDNA libraries, several cDNAs corresponding to differentially expressed genes in larvae (tetrathyridia) or segmented adult worms, and these were selected for study sequences of cDNAs corresponding to conserved genes related to development. One of the selected cDNAs codes for part of a protein orthologous to the chromodomainhelicase (CHD), usually involved in chromatin remodeling and control of gene expression in different eukaryotic species. The partial McCHD sequence was amplified from larvae RNA by RT-PCR, cloned into a modified pGEX expression vector (pGEX-TEV), and expressed in Escherichia coli as a fusion with GST, being purified by affinity chromatography followed by TEV protease digestion. The recombinant recMcCHD was used to immunize rabbits and produce a specific antiserum, which, in immunoblot, confirmed the differential expression of native McCHD (~200 kDa) in tetrathyridia, with a lower level of expression in adults. Immunohistochemistry experiments and transcriptional analysis by RTqPCR will now be conducted to better characterize the expression pattern of space-time along the McCHD development process of M. corti.