Risco ocupacional em fumicultores : genotoxicidade associada à suscetibilidade genética

Abstract

Agricultores envolvidos no cultivo do tabaco estão constantemente expostos a uma grande variedade de químicos. O uso de agrotóxicos em larga escala tem provocado danos à saúde destes trabalhadores assim como a manipulação das folhas de fumo úmidas, pois além de substâncias antropogênicas persistentes outros compostos orgânicos com potencial pesticida estão presentes nas folhas do tabaco. A nicotina, através do contato dermal com as folhas do fumo, tem causado um envenenamento agudo nos trabalhadores da lavoura. O conjunto de sintomas desta exposição é conhecido como doença da folha verde. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito genotóxico em fumicultores expostos ocupacionalmente a agroquímicos e nicotina. A instabilidade genômica, a morte celular, a dosagem de colinesterase, cotinina e marcadores de estresse oxidativo bem como o conteúdo de elementos traço foram analisados nas células destes trabalhadores. Para verificar a possível modulação de genes de suscetibilidade com os resultados dos biomarcadores, os polimorfismos dos genes GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2A6, PON, OGG1, RAD51, XRCC1 e XRCC4 foram avaliados. No primeiro momento, amostras de sangue periférico foram coletadas de 30 indivíduos expostos e de 30 indivíduos não expostos com o intuito de investigar o risco ocupacional em três diferentes períodos da safra de fumo (entresafra, aplicação intensa de pesticidas e na colheita da folha). Neste estudo foi observado aumento significativo de dano ao DNA, avaliado pelo ensaio Cometa, em fumicultores comparados ao grupo não exposto em todos os períodos da safra e, um significante aumento nas frequência de células micronucleadas na entresafra. Correlação entre idade e tempo de exposição em relação aos resultados do ensaio Cometa e do teste de MN não foi encontrado. O dano ao DNA foi maior em homens comparado a mulheres, mas diferença significativa foi observada apenas na entresafra. Não houve diferença na atividade da colinesterase entre os grupos estudados. Elevado nível de cotinina foi observado na colheita da folha de fumo, demonstrando exposição à nicotina. Em um segundo momento, amostras de sangue periférico e de mucosa oral foram coletadas de aproximadamente 111 agricultores em dois períodos da safra (na aplicação intensa de pesticidas e na colheita) e de 56 indivíduos não expostos. Os resultados destes testes demonstraram anomalias nucleares nas células de fumicultores expostas a misturas de substâncias com potencial genotóxico e citotóxico. Diferença nos resultados foi percebida entre os dois momentos da safra de fumo investigados. Modulação no dano ao DNA e na morte celular em células da mucosa oral foi observada nos genes PON1 e CYP2A6. Diferença entre gênero e tempo de exposição não foi encontrada nos diferentes parâmetros analisados. Houve correlação entre idade e os resultados obtidos no teste de MN em linfócitos no grupo não exposto e no momento da aplicação de pesticidas. Em relação ao uso do equipamento de proteção individual, diferença na frequência de MN no momento da aplicação de pesticidas foi observada. Dos nove marcadores de suscetibilidade estudados, somente GSTM1 nulo e CYP2A6*9, demonstraram associação com os resultados obtidos pelo teste de MN em linfócitos. Diferença na atividade da colinesterase e nos níveis de cotinina não foi observada em relação aos diferentes genótipos de PON1 e de CYP2A6, respectivamente. Aumento de cromo, magnésio, alumínio, cloro, zinco e potássio foram percebidos no momento da aplicação de pesticidas em relação ao grupo não exposto e à colheita. Maior atividade da superóxido dismutase no grupo exposto em relação ao grupo não exposto foi observada. Atividade da catalase e a medida de TBARS apresentaram aumento significativo na colheita da folha de fumo em relação ao grupo não exposto e ao momento da aplicação de pesticidas. Finalmente, esta investigação sugere níveis maiores de dano ao DNA avaliados pelo ensaio Cometa e pelo teste de MN em linfócito e em mucosa oral, nos diferentes momentos da safra do fumo (aplicação de pesticides e colheita), chamando a atenção o significativo aumento de dano ao DNA no momento da entresafra. Modulação dos genes de metabolismo foi observada, onde GSTM1 nulo e PON1 Gln/Gln tiveram maiores níveis de dano ao DNA, em linfócitos e em células da mucosa oral respectivamente, no momento da aplicação de pesticidas e CYP2A6*1/*1 e CYP2A6*9/- tiveram maiores níveis de dano ao DNA (em linfócitos) e de morte celular (em células da mucosa oral) na colheita. Não houve influência dos genes envolvidos no reparo em relação aos diferentes biomarcadores no grupo exposto. Os resultados indicam que exposição crônica a pesticidas, tanto químicos sintéticos como natural, pode ativar o sistema de enzimas antioxidantes. Por fim, nosso estudo chama a atenção à necessidade de formação profissional e informação sobre práticas seguras no uso de pesticidas e, além disso, na fumicultura, na manipulação das folhas fumo.

Agricultural workers engaged in tobacco cultivation are constantly exposed to large amounts of pesticides as well as to the nicotine present in raw tobacco leaves. Pesticides have been considered potential chemical mutagens. Studies have assumed that nicotine absorbed through the skin results in the characteristic green tobacco sickness (GTS), an occupational illness reported by tobacco workers. This study sought to determine genotoxic effects in farm workers occupationally exposed to agrochemicals and nicotine. The genomic instability, cell death as well as cholinesterase and cotinine levels in the blood of tobacco farmers were investigated. In order to verify relation of genetic susceptibility with biomarkers results, GSTT1, GSTM1, GSTP1, CYP2A6, PON, OGG1, RAD51, XRCC1 and XRCC4 genes polymorphisms was evaluated. Determination of oxidative stress markers and trace elements content was accomplished. In the first moment, peripheral blood samples were collected from 30 agricultural workers and 30 non-exposed subjects to investigate occupational exposure in three different crop times (off-season, during pesticides application and leaf harvest). In this study a significant increase in DNA damage, assessed by Comet assay, was observed in tobacco farmers compared to the nonexposed group, for all different crop times, and a significant increase in micronucleated cells was detected in the off-season group. No correlation was found between age and exposure time in relation to biomarker tests. The DNA damage was greater in males than in females, but with a significant difference only in off-season group. No difference, in cholinesterase activity, was seen among the group of farmers and non-exposed group. Increased level of cotinine was observed in leaf harvest group. In the second moment, peripheral blood and buccal cells samples were collected about from 111 agricultural workers, at two different crop times (during pesticides application and leaf harvest), and 56 non-exposed individuals. Results showed nuclear anomalies in the blood and buccal cells in tobacco farmers exposed to mixture of the substances with genotoxic and cytotoxic potential. Difference in blood and buccal micronucleus cytome assay results was found among two different times in the tobacco crop. Effects of PON1 and CYP2A6 genetic polymorphisms on the modulation of DNA damage induced by pesticides and cell death were observed in buccal micronucleus cytome (BMNcyt) assay. No statistically significant difference was found between genders and exposure time for all parameters analyzed. No difference was observed in hematocrit values between the groups. Correlation was observed in age and cytokinesis-blocked micronuclei (CBMN) assay results in nonexposed and pesticide application group. In relation to personal protective equipment (PPE) use, increased MN frequency in pesticide application was observed. From the nine markers of individual susceptibility studied in the CBMN assay, only GSTM1 null and CYP2A6*9, showed significant associations with results in farmers cells. Increase in cotinine level was observed in leaf harvest, when compared to non-exposed group. Cholinesterase (BChe) level was similar in the farmer and non-exposed group. No significant effect on the BChe activity and cotinine level was observed in exposed group with reference to different PON1 and CYP2A6 genotypes, respectively. In pesticide application was found increase in chromiun, magnesium, aluminum, chloride, zinc and potassium, when compared to non-exposed and leaf harvest group. Superoxide dismutase (SOD) activity presented a significant increase in exposed groups (pesticide application and leaf harvest) in relation to non-exposed group, and pesticide application presented higher values than leaf harvest group. The catalase (CAT) activity and TBARS presented a significant increase in leaf harvest than non-exposed group and pesticide application. Finally, this investigation suggests that DNA damage increases, analyzed by Comet, CBMN and BMNcyt assays, at different tobacco crop stages (pesticides application and tobacco leaf harvest), calling attention to the significant increase in the DNA damage during the off-season. Effect of individual genotype of the metabolism genes on the level of different biomarkers evaluated in exposed group demonstrated an influence on increase in damage of GSTM1 null (blood cells) and PON1 Gln/Gln (buccal cells) on pesticides application group, and a influence of CYP2A6*1/*1 (blood cells) and CYP2A6*9/- (buccal cells) on tobacco leaf harvest group. Individual genotype of the DNA repair genes of exposed groups did not show influence on the different biomarkers in this study. In pesticide application was found increase of trace elements content. The results also indicated that chronic exposure to pesticides, synthetic and natural, can influence antioxidant enzymes activity. Our study drives the attention once more to the need for occupational training on safe working practices and safe work environment for farm workers. Developing countries should use such data to establish safety occupational rules during the use of pesticides and mainly during tobacco leaf harvest.