Padronização da diferenciação in vitro e a ativação clássica ou alternativa da linhagem de células humanas U937 em macrófagos

Abstract

Introdução: Macrófagos de fenótipo M1 (ativação clássica) e M2 (ativação alternativa) estão relacionados com diversos processos patológicos como o câncer, a aterosclerose e doenças neurodegenerativas. No microambiente tumoral, os macrófagos associados ao tumor (TAM) têm atuação controversa na progressão da doença. Um modelo in vitro pode servir para avaliar a influência dessa alteração fenotípica em diversas patologias. A linhagem celular monocítica humana U937, sob estímulo de PMA (do inglês, Phorbol 12-myristate 13-acetate), se diferencia em macrófagos típicos. Estes adquirem fenótipos M1 e M2 quando estimulados, respectivamente, por LPS/IFN- e IL-4. Objetivo: Estabelecer um modelo in vitro para o estudo do papel dos macrófagos e seu envolvimento na progressão de doenças, bem como, sua caracterização fenotípica nesses eventos. Para tal, utilizamos: a) meta-análise de dois conjuntos de dados de micro-arranjos para avaliar os genes relacionados e b) análise de marcadores de diferenciação celular, taxa de adesão, alterações morfológicas e níveis de espécies reativas. Métodos: Cultura Celular: Linhagem celular humana U937, cultivada com meio de cultura RPMI 1640 e tratada com 10nM de PMA, por 12, 24, 48 e 72 horas. Quantificação de Espécies Reativas de Oxigênio: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas incubadas com a sonda DCF para avaliar a formação de espécies reativas, medida fluorescência por 1h. Ensaio de MTT e Adesão Celular: Células U937 diferenciadas e indiferenciadas foram incubadas com solução de MTT por 1h, para análise da viabilidade celular, foi medida absorbância em 560nm e índice de adesão por método de SRB. Produção de óxido Nítrico: Quantificado pelo método de Griess, a 540nm. Análise Morfológica por meio de Imagens das Células: Imagens obtidas após tempos de tratamento com PMA em 0, 12, 24, 48 e 72 horas. Bioinformática: a) obtidos dois conjuntos de dados de micro-arranjos do Gene Expression Omnibus (GEO) - GSE5099 e GSE15038; b) criamos redes de genes para o fenótipo M1 e M2, com ferramenta on-line STRING e software MEDUSA; c) rede de genes e informações dos micro-arranjos foram combinados e plotados em gráficos de acordo com a sua topologia, com software ViaComplex. Resultados: As imagens mostraram alteração morfológica característica da célula monocítica U937 (célula proliferativa) para macrófago (célula aderida na placa), quando tratadas com PMA. Quanto aos níveis de espécies reativas formadas e a taxa de aderência medida, foi maior nas células tratadas, no decorrer do tempo de tratamento. A taxa de proliferação da célula controle U937 aumentou com o tempo, enquanto que, observamos uma diminuição na proliferação das células tratadas com PMA. A análise bioinformática mostrou um aumento na expressão, tratadas x controle, de genes do fenótipo M1 e M2, nas células U937 diferenciadas por PMA e polarizadas com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. O fenótipo M1 mostrou aumento na formação de ER e de NO quando tratado com LPS + IFN-gamacombinados. Houve uma diminuição de NO no fenótipo M2 quando ativadas por IL-4. Conclusão: Nosso trabalho descreve um método válido de diferenciação macrofágica da linhagem humana U937 e a possibilidade de sua polarização ao fenótipo M1 e M2 quando estimulada com PMA e posteriormente com LPS/IFN gama e IL-4, respectivamente. A compreensão das relações entre as alterações fenotípicas dos macrófagos e do microambiente gerado é importante para o desenvolvimento de pesquisas para combater/atenuar a agressividade das patologias.

Introduction: In vitro model of macrophages (MF) can be used to evaluate the influence of these cells in human pathologies. Objective: To establish an in vitro model to study macrophages and it’s evaluating M1/M2 polarization. Methods: The human U937 cell line was grown in medium RPMI 1640 and differentiated into functional macrophages by 10 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-treatment, with M1 or M2 phenotypes with LPS/IFNg and IL-4, respectively. Reactive Oxigen Species (ROS) (time course of DCF oxidation), nitric oxide (NO) (Griess method), cell proliferation (MTT assay) and adherence (SRB method), and change in cellular morphology were determined. Moreover, two microarray data sets from Gene Expression Omnibus (GEO) (GSE5099 and GSE15038) were used to analyze differential M1/M2 gene expression with the online bioinformatics tools STRING, MEDUSA and Via Complex. Results: Time course experiments (0, 24, 48 and 72h) showed decreased cell proliferation with increase in morphological changes, cell adherence and ROS generation in PMA-treated U937 cells compatible with the acquisition of a macrophage-like phenotype. Bioinformatics approach showed increased expression in M1/M2 genes by PMA-treatment. 24h of LPS/IFNg- treatment induced increased NO, ROS, and the expression of M1 genes (classical activation MF), while 24h IL-4-treatment induced the expression of M2genes (alternative activation MF). Conclusion: This simple human macrophage-like differentiation and M1/M2 activation protocol could be used in vitro to establish the role of these cells in human pathologies.