Uso da frutose-1,6-bisfosfato em ilhotas pancreáticas mantidas em cultura celular

Abstract

O diabetes mellitus tipo 1 (DM1) é uma síndrome autoimune órgão-específica caracterizada pela destruição seletiva de células β nas ilhotas pancreáticas. Dentre as estratégias de tratamento disponíveis estão a insulinoterapia, o transplante de pâncreas, e, ainda em caráter experimental, o transplante de ilhotas pancreáticas. O transplante de ilhotas oferece vantagens por ser um procedimento pouco invasivo. O principal fator envolvido no sucesso do transplante de ilhotas é a necessidade de um número mínimo de ilhotas viáveis e funcionais a ser transplantado. Tentando minimizar a perda associada ao procedimento de isolamento/purificação de ilhotas pancreáticas, uma das estratégias é incubar as ilhotas com diferentes moléculas citoprotetoras. Dentre delas, tem sido demonstrada a ação protetora da frutose-1,6-bisfosfato (FBP) associada a um efeito antiinflamatório, estimulando a glicólise e impedindo a formação de radicais livres. Neste trabalho, nosso objetivo foi avaliar a ação citoprotetora da FBP sobre ilhotas pancreáticas murinas mantidas em cultura celular. Foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6. Os animais foram eutanasiados por deslocamento cervical e submetidos à tricotomia e laparotomia abdominal em U. O pâncreas foi distendido com uma solução de colagenase tipo V e posteriormente removido. O tecido digerido foi filtrado e as ilhotas obtidas foram separadas por centrifugação isopícnica em gradiente de ficoll (Cellgro). As células isoladas foram mantidas em cultura por 24h com meio CMRL suplementado com 10% de soro fetal bovino e diferentes concentrações de FBP. A viabilidade foi determinada pela marcação das células com diacetato de fluoresceína (FDA) e iodeto de propídeo (PI). As imagens das ilhotas coradas com FDA/PI foram adquiridas em um Microscópio Confocal FV1000 (Olympus). O percentual de viabilidade foi calculado pela quantificação da área positiva para PI em relação à área total da ilhota, e as diferenças entre os grupos foram determinadas por ANOVA de uma via seguido pelo teste de post-hoc de Duncan. A análise estatística demonstrou que a incubação das ilhotas pancreáticas em altas concentrações de FBP (1,25mM; 2,5mM e 5mM) reduz a morte celular das ilhotas pancreáticas quando comparadas ao grupo controle (P<0,05), comprovando a hipótese da ação citoprotetora da FBP. A descoberta de moléculas citoprotetoras que possam aumentar ou preservar as culturas in vitro de ilhotas pancreáticas por diferentes períodos é de vital importância no auxílio do transplante dessas células.

Diabetes mellitus type 1 (DM1) is an autoimmune syndrome characterized by organ-specific selective destruction of β-cells in the pancreatic islets. Among the strategies available for treatment we found insulinotherapy, pancreas transplantation, and transplantation of pancreatic islets, in experimental. The islet transplantation offers advantages because it is less invasive. The principal factor involved in the success of islet transplantation is the need for a minimum number of viable, functional islets to be transplanted. Trying to minimize the loss associated with the procedure of isolation/purification of pancreatic islets, one of the strategies is incubating the islets with different cytoprotective molecules. It has been verified the protective action of fructose-1,6-bisphosphate (FBP) metabolism associated with an antiinflammatory effect, stimulating glycolysis and preventing the formation of free radicals. In this work, our objective was to evaluate the cytoprotective effect of FBP on murine pancreatic islets maintained in cell culture. We used isogenic lineage C57BL/6. The animals were euthanatized by cervical dislocation and submitted to trichotomy and abdominal laparotomy in U. The pancreas was distended with collagenase type V and subsequently removed. The digested tissue was filtered and the collected islets were separated by isopycnic centrifugation in Ficoll gradient (Cellgro). The isolated cells were maintained in culture for 24h with CMRL supplemented with 10% fetal bovine serum and different FBP concentrations. Viability was determined by staining the cells with fluorescein diacetate (FDA) and propidium iodide (PI). The images of islets stained with FDA / PI were acquired with FV1000 Confocal Microscope (Olympus). The viability was calculated by quantifying the positive PI area in relation to the total area of the islet, and the differences among groups were determined by one-way ANOVA test followed by post-hoc Duncan. Statistical analysis showed that incubation of pancreatic islets in high concentrations of FBP (1.25 mM, 2.5 mM, 5 mM) preserves the viability of pancreatic islets compared with the control group (P <0.05), confirming the hypothesis of cytoprotective action of FBP. The discovery of cytoprotective molecules that can enhance or preserve pancreatic islets cultures in vitro for different periods is vital in helping the transplantation of these cells.