Virulência de lactobacilos da microbiota residual de dentina cariada

Abstract

O objetivo do estudo foi avaliar o efeito do selamento de lesões dentinárias de cárie sobre a virulência de Lactobacilos através da produção de ácido (P.A) e tolerância ácida (T.A). Pacientes (n=18) com lesões dentinárias foram submetidos à remoção parcial de tecido cariado e selamento da cavidade por 3 meses. Amostras de dentina foram obtidas antes e após o selamento. As amostras foram cultivadas em Ágar Rogosa, por 72 horas em anaerobiose. Até sete cepas de cada tipo morfológico foram selecionadas e armazenadas em caldo de Brain Heart Infusion (BHI) e glicerol em -20º C. As amostras foram analisadas quanto à coloração de Gram e morfologia. Somente bacilos e cocobacilos gram-positivos foram mantidos na amostra. Do total de 18 pacientes, somente seis apresentaram crescimento de Lactobacilos antes e após selamento. Nas análises de P.A e T.A foram avaliadas 66/62 cepas cultivadas antes e 75/74 cepas após o selamento, respectivamente. Para avaliação da produção de ácido, as cepas foram ressuspensas em 5 mL de caldo BHI e incubadas a 37º C, em anaerobiose durante 18 horas. Após lavagem, as cepas foram ressuspensas em caldo BHI, enriquecido com glicose a 1% a uma densidade óptica de 0,03 a 600 nm (DO600). As amostras foram incubadas a 37º C e alíquotas foram utilizadas para avaliação de pH em 9, 24, 48 e 72 horas, em triplicata. Um controle negativo foi incubado nas mesmas condições. As análises estatísticas foram realizadas nos diferentes períodos de avaliação (teste t- Student). Para realização do experimento de T.A, os isolados foram ressuspensos em 2 mL de caldo BHI e incubados a 37º C em anaerobiose durante 18 horas. Alíquotas foram ressuspensas em BHI caldo pH 7 e pH 4 a uma densidade óptica de 0,03 a 600 nm (DO600). Vinte e cinco microlitros das diluições 10-4 e 10-5 foram plaqueadas em BHI ágar no tempo 0 e após 30 minutos de incubação em anaerobiose a 37º C. Foi calculado a média±DP do número de UFC/mL do tempo 0 e após 30 minutos (pH 7 e pH 4). A taxa de crescimento durante 30 minutos foi comparada em cada grupo (pH 7 e pH 4 antes do selamento, pH 7 e pH 4 depois do selamento) (teste ANOVA). A produção de ácido (média±DP) dos Lactobacilos isolados antes e após o selamento, respectivamente, nos diferentes períodos de tempo foram: 9h (6,08±0,70-5,96±0,79 p=0,32), 24h (4,40±0,16- 4,37±0,15 p=0,26), 48h (4,21±0,12-4,21±0,15 p=0,87) e 72h (4,18±0,11-4,19±0,21 p=0,65). A taxa de crescimento antes do selamento no pH 7 foi de 1,770,32 log10 UFC/mL e após o selamento foi de 1,730,29 log10 UFC/mL (p=1.00). A taxa de crescimento antes do selamento no pH 4 foi de 1,670,37 log10 UFC/mL e depois do selamento foi de 1,600,34 log10 UFC/mL (p= 0.92). Não foi observado diferença na virulência de Lactobacilos antes e após o período de selamento utilizando a técnica de curva de pH e T.A.

The aim of this study was to evaluate the effect of sealing in the virulence traits of the residual Lactobacillus spp. cultivated from carious dentin using acid production (A.P) and acid tolerance (A.T). Patients (n = 18) with permanent molar with carious lesion were submitted to partial caries removal and cavity sealing for 3 months. Dentin samples were obtained before and after sealing. The samples were cultured on Rogosa agar for 72 hours under anaerobic conditions. Up to seven isolates of each morphological type were selected and stored in Brain Heart Infusion (BHI) broth and glycerol at -20º C. The samples were analyzed for Gram staining and morphology. Only bacilli and coccobacilli gram-positive were kept in the sample. Of the 18 patients, six showed growth of Lactobacillus spp. before and after sealing. For the analysis of A.P and A.T it was evaluated 66/62 isolates cultivated before and 75/74 after sealing, respectively. To perform the A.P, isolates were resuspended in 5 ml of BHI broth and incubated anaerobically at 37º C for 18 hours. After being washed, aliquots were resuspended in BHI broth supplemented with 1% glucose at an optical density of 0.03 at 600nm (OD600). The samples were incubated at 37° C for 3 days. In order to perform the pH curve, aliquots were removed and the pH measured at 9, 24, 48 and 72 h. Tubes without inoculums (negative control) were incubated under the same conditions. The samples were performed in triplicate. Statistical analyzes were carried out in different periods (Student´s t test). To perform the experiment of A.T, the isolates were resuspended in 2 ml of BHI broth and incubated anaerobically at 37º C for 18 hours. Aliquots of this culture were resuspended at pH 7.0 and pH 4.0 at an optical density of 0.03 at 600 nm (OD600). Twenty-five microliters of the 10-4 and 10-5 dilutions were plated in BHI agar at time 0 (Baseline) and after 30 minutes of anaerobic incubation at 37º C. This experiment was performed in triplicate. The mean±SD of the triplicate CFU values was calculated at baseline and after 30 minutes (pH 7.0 and pH 4.00. The growth rate during 30 minutes was compared in each group (pH 7.0 and pH 4.0 before; pH 7.0 e pH 4.0 after cavity sealing) (ANOVA test). The acid production (mean±SD) of Lactobacillus spp. cultivated from dentin before and after sealing, respectively, in different time periods were: 9 h (6.08±0.70-5.96±0.79, p = 0.37), 24 h (4.40±0.16-4.37±0.15, p=0.26), 48 h (4.21±0.12-4.21±0.15, p = 0.87) and 72 h (4.18±0.11- 4.19±0.21, p = 0.65). The growth rate before the sealing at pH 7.0 was 1.77 (± 0.32) log10 CFU/ml and after sealing was 1.73 (±0.29) log10 CFU/ml (p = 1.00). The growth rate before the sealing at pH 4.0 was 1.67 (±0.37) log10 CFU/ml and after sealing was 1.60 (±0.34) log10 CFU/ml (p = 0.92). No difference was observed in the virulence of Lactobacillus spp. before and after sealing using A.P and A.T.