Caracterização da rVTDCE de Rhipicephalus (Boophilus) microplus : uma peptidase antimicrobiana

Abstract

O carrapato bovino, Rhipicephalus (Boophilus) microplus, é um artrópode hematófago, responsável por importantes perdas na pecuária. Durante o desenvolvimento do embrionário do carrapato a cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) participa do processo de hidrólise de vitelina (Vt), a principal fonte de energia e aminoácidos durante esse período. Devido à sua importância na fisiologia do parasita, a VTDCE é um alvo potencial para o desenvolvimento de vacinas anti-carrapatos. Estudos anteriores demonstraram que a VTDCE nativa, purificada de ovos confere proteção contra R. microplus, desencadeada pela resposta imune dos bovinos após a administração deste antígeno. Entretanto, o extenso e dispendioso processo de purificação desta proteína, acrescido do baixo rendimento e fonte escassa de material (ovos de carrapato) inviabiliza a utilização da proteína nativa para fins comerciais. Tais dificuldades podem ser ultrapassadas por meio do uso de uma proteína recombinante. O presente trabalho tem por objetivo a expressão, purificação e caracterização da VTDCE recombinante (rVTDCE). Parte da sequência de aminoácidos da VTDCE nativa foi obtida por sequenciamento de edman e pela análise por especrometria de massas de petídeos obtidos pelo tratamento da proteína com tripsina e. As sequências obtidas assim obtidas foram utilizadas para buscar a sequência da ORF da VTDCE em um banco de cDNA. Por meio de PCR, a ORF da enzima foi clonada em vetor de clonagem e posteriormente de expressão. A rVTDCE expressa em Escherichia coli foi purificada por cromatografia de afinidade e utilizada para determinar algumas de suas propriedades, como atividade enzimática e antimicrobiana. A atividade enzimática foi avaliada através de ensaios fluorimétricos, onde a rVTDCE mostrou características similares à VTDCE nativa. Ensaios antimicrobianos foram realizados para avaliar a possível atividade sugerida após análise da sequencia da ORF da VTDCE. A análise molecular mostrou que a sequência da VTDCE apresenta semelhança com peptídeos antimicrobianos, fato comprovado através de ensaios antimicrobianos. Efetivamente, a VTDCE apresentou atividade antimicrobiana tanto na sua forma nativa como na forma desnaturada desprovida de atividade peptidásica, demonstrando que ambas as atividades são independentes. Foram feitos também ensaios imunológicos, onde anticorpos policlonais anti-rVTDCE foram produzidos em coelhos e bovinos. Por Western blot foi observado que os anticorpos policlonais produzidos contra VTDCE recombinante reconheceram a VTDCE nativa, e o inverso também, indicando que a forma recombinante pode ser utilizada para experimentos de vacinação.

The cattle tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus is a hematophagous arthropod, responsible for significant losses in livestock. During the tick embryo the vitellin-degrading cysteine endopeptidase (VTDCE) participates in the vitellin (Vt) hydrolysis, the main energy source and amino acids during this period. Due to the importance of this enzyme in parasite physiology the VTDCE is a potential target for development of anti-tick vaccine. In previous studies, the immunization with native VTDCE, purified from tick egg, conferred protection against R. microplus. However, the extensive and expensive purification process, plus the low achievement precludes the use of the native protein for commercial purposes. This difficulty can be overcome by the expression of a recombinant protein in heterologous organism. This work aims the expression, purification and characterization of recombinant VTDCE (rVTDCE). Part of the native VTDCE amino acid sequence was determined by Edman sequencing. Native protein was also trypsinized and peptides sequenced by mass spectrometry. The sequences obtained from mass spectrometry and Edman sequencing were used to search the ORF sequence of VTDCE in a tick cDNA library. Through PCR enzyme ORF was cloned into a cloning vector and further into an expression vector. The rVTDCE expressed in Escherichia coli was purified by affinity chromatography and used to determine some of its properties such as antimicrobial and enzyme activity. The enzymatic activity was measured using fluorimetric assays, where rVTDCE had similar characteristics to VTDCE. Antimicrobial assays were performed to evaluate the possible activity suggested after sequence analysis. Molecular analysis showed that the sequence of VTDCE shows similarity with antimicrobial peptides, which was proven through antimicrobial assays. Effectively, the VTDCE presented antimicrobial activity even when the protein didn’t present enzymatic activity, demonstrating that both activities are independent. Immunological assays were also performed. Polyclonal anti-rVTDCE serum were produced in rabbits and cattle. Western blot showed that the polyclonal antibodies raised against recombinant VTDCE recognized the native form, indicating that the recombinant form may be used for vaccination experiments.