Estudo da hidrólise extracelular de nucleotídeos em Trichomonas gallinae

Abstract

Trichomonas gallinae é um protozoário flagelado que parasita o trato digestivo superior de várias aves, incluindo pombos domésticos, frangos e perus. O estudo dos mecanismos de patogenicidade deste parasito é de fundamental importância, uma vez que a infecção causada pelo mesmo tem envolvido grandes perdas econômicas. Sabe-se que além da função energética, o ATP desempenha inúmeras funções fisiológicas, como sinalização extracelular e mecanismos citolíticos. As concentrações dos nucleotídeos, tais como ATP e ADP, no meio extracelular são controladas por um grupo de enzimas denominadas ectonuncleotidases. Fazem parte deste grupo as NTPDases (nucleosídeo trifosfato difosfoidrolases) e a ecto-5´- nucleotidase, as quais participam do controle dos níveis extracelulares dos nucleotídeos e nucleosídeos. A presença dessas atividades enzimáticas pode estar associada com a virulência e evasão dos parasitos, servindo como um mecanismo de escape dos efeitos citolíticos do ATP. Portanto, este estudo teve como objetivo caracterizar as atividades da NTPDase e 5´-nucleotidase, envolvidas na degradação dos nucleotídeos extracelulares em T. gallinae. A hidrólise de ATP, ADP e AMP foi ativada na presença de cátions divalentes e a adição de quelantes de cátions no meio de incubação reduziu significativamente a atividade específica da NTPDase e 5´-nucleotidase. As enzimas apresentaram ampla especificidade de substrato, observada através da hidrólise de outros nucleotídeos trifosfatados, difosfatados e monofosfatados, quando adicionados ao meio como substrato. O KM para o ATP foi de 65,62 ± 15,55 μM e para o ADP foi de 122,66 ± 3,51 μM. A Vmax para o ATP e o ADP foi de 0,20 ± 0,03 e 0,70 ± 0,09 nmolPi/min/106 trofozoítos, respectivamente. Para o AMP, o KM foi 466 ± 57 μM, com uma Vmax de 3,70 ± 0,59 nmolPi/min/106 trofozoítos. A influência de outras enzimas que hidrolisam nucleotídeos extracelulares foi descartada através do uso de inibidores específicos. A hidrólise do ATP, ADP e AMP indicou a presença de uma cadeia enzimática na superfície do parasito, composta por uma NTPDase e uma ecto-5’-nucleotidase. A presença de atividades enzimáticas capazes de hidrolisar nucleotídeos extracelulares pode representar um mecanismo de sobrevivência dos parasitos nos seus ambientes naturais. A compreensão dos processos bioquímicos extracelulares destes parasitos pode ampliar o conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos no parasitismo.

Trichomonas gallinae is a flagellated protozoan which parasitizes a variety of birds all over the world, including domestic pigeons, chickens and turkeys. The study of patogenicity mechanisms is relevant, since the infection caused by this parasite involves significant economic loss. Besides the energetic function, extracellular ATP plays several physiological functions, such as extracellular signaling and cytolysis. Extracellular nucleotide levels are controlled by group of enzymes named ectonucleotidases. This group of enzymes includes the NTPDases (nucleoside triphosphate diphosphohydrolases) and an ecto-5´-nucleotidase, which participates in the control of extracellular nucleotide and nucleoside levels. The presence of these enzyme activities could be associated with the virulence and evasion of the parasites, escaping from the cytolytic effects of ATP. Therefore, the aim of this study was to characterize the NTPDase and 5´-nucleotidase activities, involved in extracellular nucleotide degradation in T. gallinae. ATP, ADP and AMP hydrolysis were activated in the presence of divalent cations and the addition of cation chelating agents in the incubation medium significantly decreased the specific activity of NTPDase and 5´-nucleotidase. The enzymes presented broad substrate specificity because others triphosphate, diphosphate and monophosphate nucleotides were also hydrolysed when they were added to the mixture as substrates. The KM value for ATP was 65.62 ± 15.55 μM and for ADP was 122.66 ± 3.51 μM. The Vmax values for ATP and ADP were 0.20 ± 0.03 and 0.70 ± 0.09 nmolPi/min/106 trichomonads, respectively. For AMP, KM was 466 ± 57 μM, with the Vmax value of 3.70 ± 0.59 nmolPi/min/106 trichomonads. The influence of other enzymes able to hydrolyze extracellular nucleotides was tested through the use of specific inhibitors. ATP, ADP and AMP hydrolysis indicated the presence of an enzyme chain in the surface of the parasite, composed by an NTPDase and an ecto-5´-nucleotidase. The presence of enzyme activities able to hydrolyze extracellular nucleotides can represent a survival mechanism of the parasites in their natural environments. The study of extracellular biochemical processes of these parasites can improve the knowledge related to the mechanisms involved in the parasitism.