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Papel de ureases na nodulação de Glycine max por Bradyrhizobium japonicum

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Papel de ureases na nodulação de Glycine max por Bradyrhizobium japonicum

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Título Papel de ureases na nodulação de Glycine max por Bradyrhizobium japonicum
Autor Silva, Monica de Medeiros
Orientador Carlini, Celia Regina Ribeiro da Silva
Co-orientador Polacco, Joseph Carmine
Data 2012
Nível Doutorado
Instituição Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Centro de Biotecnologia do Estado do Rio Grande do Sul. Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular.
Assunto Bradyrhizobium japonicum
Glycine max
Nodulacao
Urease
Resumo Ureases (EC 3.5.1.5.) catalisam a hidrólise de ureia em NH3 e CO2, sendo sintetizadas por plantas, fungos e bactérias. No solo, a urease é encontrada em microrganismos, raízes de plantas e como uma enzima extracelular ligada a compostos orgânicos e inorgânicos. Em plantas e fungos, as ureases consistem em trímeros ou hexâmeros formados por uma subunidade de 90 kDa, enquanto que enzimas bacterianas são complexos com duas ou três subunidades. A inserção de dois átomos de níquel no sítio ativo requer pelo menos três proteínas acessórias, UreD, UreF e UreG em bactérias, ou seus ortólogos em plantas e fungos. Bradyrhizobium japonicum é uma bactéria do solo que forma nódulos fixadores de nitrogênio em plantas de soja. Esse microrganismo produz uma urease, e seu papel na sinalização, tanto para a planta de soja quanto para outros organismos no complexo ambiente da rizosfera, ainda não foi investigado. Desta forma, o presente estudo objetivou purificar e caracterizar a urease de B. japonicum (BJU), bem como avaliar o papel desta enzima, tanto a de origem vegetal quanto a de origem bacteriana, no processo de nodulação da soja. A capacidade da enzima em induzir exocitose/secreção foi avaliada no teste de agregação plaquetária, utilizando-se plasma rico em plaquetas obtido de sangue de coelho e monitorando-se a agregação por turbidimetria. Observamos que a urease de B. japonicum possui a propriedade de agregar plaquetas, implicando em uma provável atividade indutora de exocitose. Ensaios de quimiotaxia demonstraram a atração exercida pela urease ubíqua recombinante de soja sobre células de B. japonicum. Para os ensaios de nodulação, sementes pré-germinadas de soja tiposelvagem (Williams 82) e de mutantes deficientes na proteína urease (eu1-sun/eu4) foram expostas a culturas de B. japonicum USDA110 (tipo selvagem), B. japonicum ΔureG (ausência de atividade ureásica) ou B. japonicum ΔureABC (ausência de urease), e semeadas em vasos de Leonard modificados. Os nódulos foram contados e pesados em diferentes tempos após a inoculação. Além disso, foi determinado o conteúdo de leghemoglobina destes nódulos e o conteúdo de nitrogênio na parte aérea das plantas, como uma maneira de estimar a eficiência da fixação biológica de nitrogênio. Plantas deficientes em urease formam nódulos maiores e em menor número que as selvagens, independente do fenótipo da bactéria. O pico de produção de leghemoglobina em plantas tipo-selvagem é maior e anterior ao pico observado nas plantas mutantes. Inibição de toda a atividade enzimática de urease nas plantas selvagens pelo inibidor fenilfosforodiamidato não causou as alterações observadas pela ausência da proteína urease nas plantas mutantes. Esses resultados sugerem que o desenvolvimento do nódulo em plantas requer a proteína urease, de maneira independente de sua atividade enzimática. Em contraste, a urease da bactéria parece não influenciar a nodulação ou a fixação biológica de N2 na planta. Concluímos que a urease da soja apresenta um papel relevante na simbiose planta - B. japonicum, independente de sua atividade ureolítica, e não compartilhado com a urease bacteriana.
Abstract Ureases (EC 3.5.1.5.) catalyze the hydrolysis of urea in NH3 and CO2, and are synthesized by plants, fungi and bacteria. In the soil, urease occurs in microorganisms and plant roots, and as an extracellular enzyme bound to organic and inorganic compounds. In plants and fungi, ureases consist of trimers or hexamers formed by a subunit of 90 kDa, whereas bacterial enzymes are complexes with two or three subunits. The insertion of two nickel atoms into the active site requires at least three accessory proteins, ureD, ureF, and ureG in bacteria, or their orthologs in plants and fungi. Bradyrhizobium japonicum is a soil bacterium that forms nitrogen fixing nodules on soybean plants. This bacterium produces a urease, and its role in signaling for both the soybean plant and other organisms in the complex environment of the rhizosphere, has not yet been investigated. Thus, the present study aimed to purify and characterize B. japonicum urease (BJU), and to evaluate the role of this enzyme, from both plant and bacteria, in the process of soybean nodulation. The induction of secretion was assessed by the ability of the enzyme to induce platelet aggregation in rabbit platelet-rich plasma monitored by turbidimetry. We found that the urease of B. japonicum possesses the property of aggregating platelets, implying a secretion inducing activity. Chemotaxis assays demonstrated the attraction of recombinant soybean ubiquitous urease upon B. japonicum cells. For nodulation assays, pre-germinated seeds of wild-type soybeans (Williams 82) and of mutants deficient in the urease protein (eu1-sun/eu4) were exposed to cultures of B. japonicum USDA110 (wild-type), B. japonicum ΔureG (lack of urease activity) or B. japonicum ΔureABC (no urease), and planted in modified Leonard jars. The nodules were counted and weighed at different times after inoculation. Additionally, we determined the leghemoglobin content of nodules and the nitrogen content in the shoots, as a way to estimate the efficiency of biological nitrogen fixation. Plants deficient in urease (eu1-sun/eu4) form fewer but larger nodules than wildtype plants, regardless of the phenotype of the bacteria. The peak of leghemoglobin production in wild-type plants is higher and earlier than the peak observed in mutant plants. Inhibition of all the enzymatic activity of urease in wild-type plants by phenylphosphorodiamidate did not result in the alterations seen in mutant plants lacking urease. These results suggest that the development of nodule requires the protein urease, but not its enzyme activity. In contrast, the bacterial urease seems to play no roles in the nodulation and biological N2 fixation in the plant. We conclude that the soybean urease plays an important role in the soybean - B. japonicum symbiosis, which is independent of its ureolytic activity and is not shared by the bacterial urease.
Tipo Tese
URI http://hdl.handle.net/10183/90467
Arquivos Descrição Formato
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