Tampões em diluentes para resfriamento de sêmen equino.

Abstract

Nesse estudo comparou-se o efeito tamponante do HEPES e Bicarbonato de Sódio em manter o pH e a viabilidade do sêmen resfriado de pôneis da raça Brasileira. As alterações no pH ocasionadas por diferentes diluições com diluente a base de leite desnatado em pó sem tampão a 5 e a 15°C também foram medidas. No experimento 1 avaliou-se o efeito da diluição e da temperatura de resfriamento sobre a motilidade, integridade de membrana, pH e atividade mitocondrial do sêmen pré e pós resfriamento. O sêmen de nove pôneis da raça Brasileira (dois ejaculados/pônei) foi diluído em diluente a base de leite desnatado (em pó) sem tampão e refrigerado a 5 ou 15°C por 48h em três diferentes diluições (1+1, 1+2, 1+3). As três diluições não alteraram os parâmetros avaliados após a diluição a fresco. A diluição 1+1 resultou em valores maiores de pH (7,63 e 7,57, respectivamente) e menor percentual de motilidade progressiva (MP) a 5 e a 15°C. O maior percentual de células íntegras (1+1=44,16; 1+2=48,16; 1+3=50,05) foi detectado a 15°C (P < 0,01), independente da diluição. A MP foi maior nas 48h de resfriamento (39,72%; P < 0,05) quando o sêmen foi diluído a 1+3 e refrigerado a 15°C. A atividade mitocondrial (P > 0,05) em função do tempo e temperatura foi similar entre as diluições. No experimento 2 avaliou-se o efeito tampão do bicarbonato de sódio e do HEPES em diluentes sobre a viabilidade de espermatozoides resfriados a 5°C durante 48h. Os diluentes testados compunham-se de leite desnatado em pó com bicarbonato de sódio (A), HEPES (B) ou diluente sem tampão (C). O sêmen de sete pôneis da raça Brasileira (três ejaculados/pônei) foi utilizado e a motilidade progressiva foi similar entre os diluentes (P > 0,05) após a diluição. Nas 24 e 48h, a MP foi, respectivamente, para A (44,76%; 25,23%), B (51,42%; 38,09%) e C (54,05%; 41,66%). A integridade da membrana plasmática foi similar após a exposição aos três diluentes. A fresco, a atividade mitocondrial foi maior (P < 0,05) no sêmen exposto ao diluente A (A=1,05nm, B=0,81nm, C=0,79nm) e após 24h A e B foram similares (0,83nm; 0,73nm), enquanto que no diluente C observou-se menor atividade (0,64nm). Nas 48h não houve diferença (A=0,72; B=0,69; C=0,63; P > 0,05). O pH do diluente e sua osmolaridade, assim como o pH do sêmen diluído foi maior no diluente A (8; 382; 7,9), intermediário (7,5; 362; 7,32) no B e menor no C (7,16; 350; 7,07). A peroxidação lipídica e a indução da peroxidação foram similares em todos os grupos. Sugere-se que, quando da utilização do sêmen a fresco, qualquer das diluições aqui testadas pode ser utilizada com segurança. O resfriamento do sêmen por 48h modifica e eleva o pH do sêmen. Os melhores resultados foram observados com o resfriamento do sêmen a 15°C por 48h e com a diluição 1+3 em um diluente a base de leite em pó desnatado sem tampão. O bicarbonato de sódio (A) reduz a MP e aumenta o pH do sêmen. O diluente sem tampão foi considerado o mais apropriado para uso imediato na IA. Tanto o diluente com HEPES, quanto o diluente sem tampão foram adequados para o resfriamento do sêmen equino a 5°C durante 48h.

This study compared the buffering effect of HEPES and sodium bicarbonate on pH and viability of Brazilian pony semen cooled at 5°C. pH changes caused by different dilutions using skim milk powder semen extender without buffer were also measured. In experiment 1, the effect of dilution and cooling temperature on semen motility, membrane integrity, mitochondrial activity and pH pre and post cooling was investigated. Ejaculates of nine Brazilian ponies (two ejaculates per pony) were diluted, of a non buffered powder milk extender and cooled at 5°C or 15°C during 48h in three different dilutions (1+1, 1+2 and 1+3). Dilutions did not change the parameters evaluated before cooling. Samples diluted 1+1 resulted in higher pH values (7.63 and 7.57, respectively) and lowest percentage of progressive motility (PM) at 5 and 15°C. All samples cooled at 15°C showed a lower incidence of abnormal spermatozoa (1+1 = 55.84%; 1+2 = 51.84%; 1+3 = 49.95%) (P < 0.01) independent of dilution. Progressive motility was higher when semen was cooled during 48h in 1+3 dilution at 15°C (39.72%; P < 0.05). Mitochondrial activity despite of time and temperature was similar (P > 0.05) among dilutions. In experiment 2, the buffer effect of sodium bicarbonate and HEPES on extenders were evaluated considering the maintenance of sperm viability after cooling at 5°C during 24 and 48h. A non-buffered milk powder extender (C = control) and the same extender buffered with Sodium Bicarbonate (A) and HEPES (B) was used. Semen from 7 Brazilian ponies (three ejaculates / pony) was used. Immediately after dilution sperm motility was evaluated and progressive motility was similar with all extenders (P > 0.05). At 24 and 48h after cooling at 5oC sperm motility was evaluated, respectively, on groups A (44.76%; 25.23%), B (51.42%; 38.09%) and C (54.05%; 41.66%). Plasma membrane integrity was similar after exposure to the three extenders. Before cooling, mitochondrial activity was higher (P <0.05) in extender A (A = 1.05nm, B = 0.81nm, C = 0.79nm). Mitochondrial activity after cooling for 24h was 0.83nm (A), 0.73nm (B) and 0.64nm (C). After 48h it decreased to 0.72nm (A), 0.69nm (B) and 0.63nm (C) (P > 0.05), respectively. The extenders pH, osmolarity and pH of diluted semen was higher in A (8; 382; 7.9), intermediate in B (7.5; 362; 7.32) and lower in C (7.16; 350; 7.07). Lipid peroxidation and its induction were similar in all groups. It was concluded that all dilution grades in fresh semen were adequate and that pH was affected and increased when semen was extended and cooled for 48h. The best results were observed when semen was diluted at 1+3 and cooled at 15°C for 48h in a non buffered powder milk extender. Sodium bicarbonate (A) reduces progressive motility and increases semen pH. The non buffered (C) semen extender was considered more appropriated for semen dilution for immediate use in artificial insemination. The non buffered and HEPES buffered semen extenders were considered appropriated for cooling equine semen at 5°C during 48h.