Efeito de concentrações subinibitórias de vancomicina na formação de biofilme do Staphylococcus epidermidis ATCC 35984

Abstract

O Staphylococcus epidermidis tem sido considerado, um patógeno oportunista importante, pois representa o agente mais comum responsável por infecções em dispositivos médicos. Estas infecções ocorrem devido à capacidade que o micro-organismo possui de se aderir aos materiais poliméricos formando biofilme. Evidências recentes mostram que concentrações subinibitórias de vários antimicrobianos induzem um aumento do nível de persistência do biofilme em S. epidermidis, o que pode explicar, em parte, a resistência à terapia antimicrobiana. Os objetivos deste estudo foram a investigação do efeito de concentrações subinibitórias de vancomicina na formação de biofilme do Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 ao longo de um período de tempo de incubação e o estabelecimento de um protocolo de qRT-PCR. Para isto, foram utilizadas as técnicas de cristal violeta, microscopia eletrônica de varredura, microscopia confocal de varredura a laser e qRT-PCR. As concentrações utilizadas foram de 1,0 μg/mL (½ da CIM), 0,5 μg/mL (¼ da CIM) e 0,25 μg/mL (⅛ da CIM) e os tempos de incubação foram de 3, 6, 12, 24, 36 e 48 h. Os resultados demonstraram que existem alterações na morfologia do biofilme do S. epidermidis quando submetido ao crescimento e formação de biofilme juntamente com concentrações subinibitórias de vancomicina. Estas alterações mostram-se mais evidentes nas amostras tratadas com concentrações de ½ da CIM, a qual se destaca por apresentar um comportamento diferente de adesão e agregação em relação ao não tratado. Por outro lado, as concentrações de ¼ e ⅛ da CIM apresentam-se muito similares e um tempo maior de incubação (24 h) é necessário para atingir o padrão de formação de biofilme encontrado na amostra não tratada, que já se estabelece como um biofilme frágil em 6 h. Além disso, o protocolo de qRT-PCR foi padronizado com sucesso. Portanto, é necessário buscar o entendimento sobre a formação de biofilme em condições de estresse, como na presença de antimicrobianos, já que a elucidação dos mecanismos envolvidos tanto na formação de biofilme quanto na resistência aos antimicrobianos pode auxiliar no desenvolvimento de novas e efetivas estratégias terapêuticas para o difícil tratamento de infecções relacionadas com este micro-organismo.

Staphylococcus epidermidis has been currently considered an important opportunistic pathogen, as it represents the most common agent responsible for infections in medical device implants. These infections occur due to the ability of the microorganism to adhere to the polymer materials forming biofilms. Recent evidences show that several subinhibitory concentrations of antimicrobial induce an increase in the level of persistence of biofilm in S. epidermidis, which may explain, in part, the resistance to antimicrobial therapy. The objective of this study were to investigate the effect subinhibitory concentrations of vancomycin on biofilm formation by Staphylococcus epidermidis ATCC 35984 during a period of incubation and to determine a protocol for performing qRT-PCR analysis of genes involved in adhesion, biofilm formation and virulence of S. epidermidis. For this, the crystal violet technique, scanning electron microscopy, laser scanning confocal microscopy and qRT-PCR were employed. The concentrations used were 1.0 mg/mL (½ MIC), 0.5 mg/mL (¼ MIC) and 0.25 mg/mL (⅛ MIC) and the incubation times were 3, 6 12, 24, 36 and 48 hours. The results showed that there are changes in the morphology of S. epidermidis biofilm when subjected to growth and biofilm formation with subinhibitory concentrations of vancomycin. However, these changes were more evident in the samples treated with ½ MIC, which is highlighted by presenting a different adhesion and aggregation behavior in relation to the untreated sample. On the other hand, the ¼ and ⅛ concentrations of CIM were very similar and took a longer time (24h) to achieve the standard of biofilm formation found in the untreated sample, which has settled down as a weak biofilm at 6h. Furthermore, the qRT-PCR protocol was successfully standardized. Therefore, it is necessary to seek the understanding of biofilm formation in conditions of stress, such as in the presence of antimicrobials, since the elucidation of the mechanisms involved in both biofilm formation and in antimicrobial resistance can support the development of new and effective therapeutic strategies to treat difficult infections related to this microorganism.