Modelo animal de autismo induzido por exposição pré-natal ao ácido valproico : estudos comportamentais, moleculares e estratégias terapêuticas

Abstract

O Transtorno do Espectro Autista (TEA), segundo o DSM-5, se enquadra nos Transtornos do Desenvolvimento e é caracterizado por uma díade comportamental: 1) prejuízos na comunicação e interação social e 2) comportamentos repetitivos ou estereotipados. Apesar da etiologia do TEA ser desconhecida, tanto fatores genéticos quanto ambientais já foram associados à desordem, incluindo a utilização de ácido valproico (VPA) durante a gestação. Observando essa relação importante, desenvolveu-se um modelo animal de autismo induzido pela exposição pré-natal ao VPA, o qual já foi amplamente validado em aspectos comportamentais e moleculares. No primeiro capítulo desta tese, utilizamos o modelo animal de autismo obtido através de uma única injeção intraperitoneal de VPA (600mg/kg) no dia E12,5 nas ratas Wistar prenhes e testamos um tratamento pré-natal com resveratrol (RSV), através de injeções subcutâneas (3,6 mg/Kg) administradas nas ratas prenhes nos dias E6,5-E18,5. O tratamento pré-natal com RSV demonstrou ser capaz de prevenir alterações na sociabilidade recíproca, porém não teve impacto nos prejuízos na memória olfativa e comportamentos repetitivos induzidos pelo VPA. No que se refere aos dados de microRNA (miRNA), RSV foi capaz de prevenir a alteração na expressão de miR134-5p, o qual também se observou alterado em pacientes com TEA, juntamente com o miR138-5p, ambos com alvos associados à modulação do citoesqueleto na estrutura de espinhos dendríticos. Em conjunto, esses resultados demonstram que o RSV altera vias importantes no modelo, possivelmente através das suas características antioxidantes e anti-inflamatórias, as quais contrapõem os aspectos inflamatórios do VPA. Este trabalho permitiu o aprimoramento e melhor conhecimento da técnica de RT-qPCR para análise de miRNA, sendo tema do segundo capítulo da presente tese, reunindo diferentes estratégias que auxiliaram a superar potenciais problemas e interferentes no uso dessa técnica. Finalmente, no terceiro capítulo, utilizamos o modelo VPA para avaliar o efeito do tratamento pós-natal com suramina, através de uma única injeção subcutânea (20 mg/kg) administrada nos filhotes machos na idade P30. Este tratamento foi capaz de reverter alterações de sociabilidade, novidade social e comportamento do tipo ansioso, enquanto os prejuízos na sociabilidade recíproca, comportamento exploratório, estereotipia e processamento sensorial não foram revertidos por esse tratamento. Nos dados moleculares, a suramina não foi capaz de reverter o aumento de expressão nos receptores purinérgicos P2X4 (hipocampo e córtex pré-frontal medial) e P2Y2 (hipocampo), porém reverteu o aumento de IL-6 promovido pelo VPA. Assim, possivelmente a modulação comportamental associada à suramina parece não estar associada a interações específicas nos receptores purinérgicos, mas sim com uma modificação neuroimune através da interleucina pró-inflamatória IL-6, demonstrando a importância do sistema imunológico na fisiopatologia do TEA. De forma geral, a tese contribuiu para elucidar mecanismos envolvidos no desenvolvimento das características do tipo autista, demonstrando o papel relevante das alterações neuroimunes e da modulação de alvos por miRNA, as quais, em conjunto, podem contribuir para o desenvolvimento de métodos diagnósticos e adequação de estratégias farmacológicas voltados ao TEA. Palavras-chave: Comportamento animal, microRNA, neuroimune, PCR, resveratrol, sistema purinérgico, suramina, transtorno do espectro autista.

According to DSM-5, Autism Spectrum Disorder (ASD) is a developmental disorder characterized by a behavioral dyad: 1) deficits in communication and social interaction, and 2) repetitive and stereotyped behaviors. Although the etiology of ASD is still unknown, both genetic and environmental factors have been associated with the disorder, including the use of valproic acid (VPA) during gestation. Observing this important relationship, an animal model of autism induced by prenatal exposure to VPA was developed, which has already been widely validated in behavioral and molecular aspects. In the first chapter of this thesis, we used the animal model obtained through a single intraperitoneal injection of VPA (600 mg/kg) at E12.5 in pregnant Wistar rats and tested a prenatal treatment with resveratrol (RSV) by subcutaneous injections (3.6 mg/kg) administered in the pregnant rats at E6.5 to E18.5. The prenatal treatment with RSV was able to prevent changes in the reciprocal sociability, but had no impact on the deficits in olfactory memory and repetitive behavior induced by VPA. Regarding the microRNA (miRNA) data, RSV treatment was able to prevent the alteration in the expression of miR134-5p, which also was altered in ASD patients along with miR138-5p, both with targets associated with cytoskeletal modulation in the structure of dendritic spines. Taken together, these results demonstrate that RSV alters important pathways in the model, possibly through its antioxidant and anti-inflammatory properties, which counteract the inflammatory aspects of VPA. This work allowed the improvement and better knowledge of the RT-qPCR technique for miRNA analysis, which was the theme of the second chapter of this thesis, combining different strategies to overcome potential problems and interferences in this methodology. Finally, in the third chapter we used the same animal model to evaluate the effect of postnatal treatment with suramin after a single subcutaneous injection (20 mg/kg) administered to male pups at P30. This treatment was able to revert VPA-induced deficits in sociability, social novelty, and anxiety-like behavior, whilst present no effect on impairments in reciprocal sociability, exploratory behavior, repetitive behavior and sensory processing. In the molecular data, suramin was not able to reverse the increase of expression in the purinergic receptors P2X4 (hippocampus and medial prefrontal cortex) and P2Y2 (hippocampus), but reversed the VPA-induced increase of proinflammatory interleukin IL-6. Thus, behavioral modulation associated with suramin appears to be related not with specific interactions in purinergic receptors, but with a neuroimmune modification through the IL-6, indicating the importance of the immune system in the ASD pathophysiology. In general, the thesis contributed to elucidate the mechanisms involved in the development of autistic-like features, demonstrating the relevant role of neuroimmune alterations and the modulation of targets by miRNA, which, together, may contribute to the development of diagnostic methods and improvement of pharmacological strategies related to ASD.