Avaliação do efeito neuroprotetor da estimulação magnética estática em modelo in vitro da Doença de Parkinson

Abstract

Técnicas de estimulação magnética cerebral têm sido amplamente utilizadas no tratamento de doenças do sistema nervoso, como a doença de Parkinson (DP), mas seu real mecanismo de ação e efeito em modelos celulares carece de maiores investigações, principalmente no que concerne à DP. As limitações impostas pelos tratamentos farmacológicos têm colocado em foco estudos que avaliam neuroproteção sobre modelos celulares da doença, e a utilização de campos magnéticos estáticos para este fim não está descrita. Sendo assim, o objetivo principal deste trabalho foi investigar os efeitos neuroprotetores da Estimulação Magnética Estática (EME) em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y diferenciadas com ácido retinoico (AR) com citotoxicidade induzida por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 5x104 células por poço e passaram pelo protocolo de diferenciação celular que utiliza 10μM de AR durante 7 dias. No dia 7, as células foram expostas à EME durante 24 horas em um suporte para placa de cultura com 6 ímãs cilíndricos NeFeB (neodímio-ferro-boro) a uma intensidade de 0,3 T e no dia 8 estas células foram tratadas com 15μM de 6-OHDA por 24 horas. No dia 9, foram avaliadas a viabilidade celular pelo ensaio de MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio), a morte celular pela coloração com iodeto de propídeo (PI) e Hoescht_33342 (HO) e a densidade de neuritos emitidos pelas células diferenciadas através do plugin “Neurongrowth” do software ImageJ. Os grupos de tratamento foram divididos em: grupo controle; grupo 6-OHDA; grupo EME e grupo EME + 6-OHDA. O protocolo de diferenciação celular foi realizado com sucesso, sendo visualizada a projeção dos neuritos pelas células em análise de dia 7. O estabelecimento do modelo da DP in vitro por citotoxicidade com 6-OHDA foi confirmado através do ensaio de MTT, em que células que receberam a substância tiveram sua viabilidade diminuída (p<0,05) em comparação com as que não foram expostas. Foi observado um aumento na morte celular do grupo que foi exposto anteriormente à EME e posteriormente à 6-OHDA em comparação com o grupo que não sofreu o protocolo de estimulação magnética (p<0,05). A densidade de neuritos foi similar em todos os grupos de tratamento. Os resultados encontrados apontam para uma possível sensibilização das células à 6-OHDA quando a EME é aplicada previamente. Estes achados ilustram a importância de estudos que avaliam a utilização de campos magnéticos estáticos sobre modelos de células neuronais, principalmente no que diz respeito à intensidade do campo aplicado, ao tempo de exposição e ao momento em que a estimulação magnética é realizada. A realização de novos estudos que utilizem a técnica sob diferentes condições no modelo celular em questão é fundamental para a melhor compreensão de sua possível atividade neuroprotetora e também de seu mecanismo de ação.

Techniques of magnetic stimulation of the brain have been widely used in the treatment of nervous system’s diseases, such as Parkinson’s Disease (PD), but its real mechanism of action and effects in cellular models need further investigation, especially in PD. Limitations imposed by pharmacological treatments have brought studies of neuroprotection in cellular models of the disease o focus, and the use of static magnetic fields to this purpose is not described. Therefore, the main objective of this study was to investigate the neuroprotective effects of Static Magnetic Stimulation (SMS) in neuroblastoma SH-SY5Y retinoic acid (RA) differentiated cells with 6-hidroxidopamine (6-OHDA) induced cytotoxicity. Cells were plated in a 24 well plate in a density of 5x104 cells per well and treated with 10μM of AR for 7 days during the differentiation protocol. On day 7, cells were exposed to SMS for 24h in a culture plate support with 6 NdFeB (neodimium-iron-boro) magnets in an intensity of 0,3 T and on day 8 cells were treated with 15μM of 6-OHDA for 24h. On day 9, cell viability was evaluated by MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) assay, cell death by both propidium iodide (PI) and Hoescht_33342 (HO) staining, and neurite density of the differentiated cells was evaluated by the plugin “Neurongrowth” of ImageJ software. Treatment groups were divided in: control group (only RA); 6-OHDA group (RA + 6-OHDA); SMS (RA + SMS) group and SMS + 6-OHDA (RA, SMS and 6-OHDA) group. Cell differentiation protocol was successfully accomplished, as neurite projections of the cells could be visualized in day 7. Establishment of the PD in vitro model by 6-OHDA cytotoxicity was confirmed by MTT assay, in which cells treated with the substance had decreased viability (p<0,05) compared with cells that were not exposed. An increase in cell death was observed in the group previously exposed to SMS and subsequently to 6-OHDA in comparison to the group in wich the magnetic stimulation was not applied (p<0,05). Neurite density was similar in all treatment groups. The results indicate a possible sensitivity of the cells to 6-OHDA when SMS is previously applied. These findings demonstrate the relevance of studies that apply static magnetic fields on neuronal cellular models, especially with regard to intensity of the field applied, to the time of exposure and to the moment in which the magnetic stimulation is performed. New studies using this technique under different conditions on the same cellular model are essential to achieve a better comprehension of its possible neuroprotective effects and also its mechanism of action.