Avaliação dos efeitos do tratamento com quercetina e melatonina em modelo animal de nefrite lúpica induzido por pristano

Abstract

Introdução: A nefrite lúpica (NL) é uma manifestação grave do lúpus eritematoso sistêmico (LES), que pode levar à perda de função renal e necessidade de terapia renal substitutiva. O modelo animal de NL induzido por pristano reproduz a doença humana, em que se detectam autoanticorpos causando glomerulonefrite com padrão proliferativo e inflamatório, e a presença de estresse oxidativo exacerbado e de aumento da produção de marcadores pró-fibróticos. A quercetina e a melatonina são substâncias naturais que podem ser potenciais alternativas para o tratamento da NL, devido ao seu efeito antiinflamatório, antioxidante e anti-fibrótico. Objetivos: Avaliar o efeito protetor da quercetina e da melatonina em camundongos induzidos por pristano sobre a proteinúria, marcadores de inflamação, de estresse oxidativo, de apoptose e de fibrose sobre a injúria estrutural e molecular das células epiteliais podocitárias do glomérulo renal. Métodos: Camundongos BALB/c (fêmeas) com 60 dias de vida foram alojados em sala com temperatura controlada (25ºC), na Unidade de Experimentação Animal (UEA) do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório". O modelo animal de NL foi induzido por uma única injeção intraperitoneal de pristano (PT). O tratamento com melatonina iniciou um dia após a indução e com a quercetina após 30 dias da indução (PT-M e PT-Q, respectivamente) Após 180 dias da indução, os animais foram eutanasiados e os rins removidos. A análise morfológica para evidenciar lesão renal compatível com NL foi realizada com hematoxilina-eosina e ácido periódico-Schiff. Foi atribuído um escore de inflamação glomerular e tubular, descrito em porcentagem (%). Imunofluorescência e ensaios bioquímicos foram utilizados para avaliar a expressão de marcadores de inflamação (IL-6; fator de necrose tumoral-α, TNF-α), de estresse oxidativo (CAT e SOD1 antioxidantes e TBARS pró-oxidante), de apoptose (Bax) e de fibrose (TGF-β1 e colágenos I e III). A ultraestrutura glomerular e tubular foi avaliada por microscopia eletrônica (ME), e a expressão tecidual do RNA mensageiro (RNAm) de podocina, podoplanina e α3β1-integrina foram quantificados pela reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real para os camundongos tratados com quercetina. Resultados: Os camundongos induzidos com pristano desenvolveram lesões compatíveis com NL, apresentando infiltrado inflamatório, proliferação de células endocapilares, extracapilares e mesangiais, achatamento dos pedicelos dos podócitos, descolamento da borda em escova das células tubulares e mitocôndrias anormais com ruptura de cristas. Em relação aos camundongos controle (C), o grupo PT mostrou aumento da proteinúria no sexto mês (PT: 57,0±17,2 vs. C: 6,6±2,4 mg/dL; p=0,012), maior escore de inflamação (%): 7,42(5,31-8,43) vs. 0,51(0,35-2,42); p<0,001, e expressão aumentada de marcadores pró-fibróticos (p=0,009), de apoptose (p=0,009) e pró-oxidantes (p=0,001), assim como redução de antioxidantes (p=0,001) Na ultraestrutura, foram observados achatamento dos pedicelos dos podócitos, células mesangiais apoptóticas e mitocôndrias anormais com ruptura de cristas, juntamente com supressão dos RNAm de podocina (p<0,001), podoplanina (p=0,009) e α3β1-integrina (p=0,005). O tratamento com quercetina induziu nefroproteção no grupo PT-Q quando comparado ao PT, em que foi observado redução significativa na proteinúria (3,4±2,0 mg/dL, p<0,001), no escore de inflamação [4,23(2,12-6,94), p=0,041], na expressão de IL-6 (p=0,016), TNF-α (p=0,007), TGF-β1 (p=0,003) e Bax (p=0,006). A quercetina também aumentou significativamente a expressão de CAT (p=0,001) e SOD1 (p=0,003). Adicionalmente, observou-se recuperação parcial da ultraestrutura renal na ME, e maior expressão do RNAm de podocina (p<0,001) (mas não de podoplanina e de α3β1-integrina), em relação aos níveis encontrados no grupo C. Nos grupos da melatonina, o grupo PT apresentou escore de inflamação maior em relação aos camundongos controle (C) (3,49% vs. controle 0,83%; p<0,05), índice de deposição de colágeno total (2,50% vs. 0,20%; p<0,05), redução da expressão das enzimas antioxidantes (SOD1: p=0,003; CAT: p=0,012) e aumento na expressão de IL-6, de Bax e de TGF-β1 (p<0,05 para todos) Comparado aos camundongos induzidos com pristano, o grupo tratado com melatonina apresentou redução no escore de inflamação (3,49% vs. 1,2%; p<0,05), no índice de fibrose intersticial (2,50% vs. 0,36%; p=0,018), aumento da expressão de enzimas antioxidantes (SOD1: p=0,008; CAT: p=0,001) e redução na expressão de IL-6, de Bax e de TGF-β1 (p<0,05 para todos). Um menor grau de achatamento dos pedicelos dos podócitos, do espessamento da membrana basal e menor lesão mitocondrial foram observados na ME no grupo tratado com melatonina. Conclusão: Esses resultados fornecem evidências de que a quercetina e a melatonina restauram parcialmente as alterações estruturais da NL no modelo de camundongos induzido por pristano, modulando a inflamação, o estresse oxidativo, a apoptose e os marcadores pró-fibróticos, assim como a expressão do RNAm das proteínas do podócito e sua ultraestrutura. Com base nesses achados, consideramos que essas substâncias naturais podem ser uma estratégia terapêutica alternativa para minimizar a lesão renal da NL.

Introduction: Lupus nephritis (NL) is a severe manifestation of systemic lupus erythematosus (SLE), which can lead to loss of renal function and need for renal replacement therapy. The animal model of LN induced by pristane reproduces human disease, in which autoantibodies are detected causing proliferative and inflammatory glomerulonephritis, and the presence of exacerbated oxidative stress and pro-fibrotic markers. Quercetin and melatonin are natural substances that may be potential alternatives for the treatment of LN due to its anti-inflammatory, antioxidant and antifibrotic effects. Objectives: To evaluate the protective effect of quercetin and melatonin in pristaneinduced LN mice on proteinuria, markers of inflammation, oxidative stress, apoptosis and fibrosis, and on the structural and molecular injury of podocyte epithelial cells of the renal glomerulus. Methods: BALB/c mice (females) with 60 days of life, housed in a room with controlled temperature (25ºC), at the Animal Facility (UEA) of the Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). All the procedures were conducted in accordance with the “Guide for the Care and Use of Laboratory Animals". The animal model of LN was induced by a single intraperitoneal injection of pristane (PT) Treatment with melatonin started one day after induction and with quercetin after 30 days of induction (PT-M and PT-Q, respectively). After 180 days of induction, animals were euthanized and the kidneys removed. Morphological analysis to demonstrate LN-compatible renal lesion was performed with hematoxylin-eosin and periodic acid-Schiff. A glomerular and tubular inflammation score was reported as percentage (%). Immunofluorescence and biochemical assays were used to evaluate the expression of inflammation markers (IL-6, tumor necrosis factor-α, TNF-α), oxidative stress (CAT and SOD1 antioxidants and prooxidant TBARS), apoptosis and fibrosis (TGF-β1 and collagens I and III). The glomerular and tubular ultrastructure was evaluated by electron microscopy (EM), and the tissue expression of podocin messenger RNA (mRNA), podoplanin and α3β1-integrin were quantified by quantitative real-time polymerase chain reaction for the quercetin-treated mice. Results: Pristane-induced mice developed compatible lesions with LN, presenting inflammatory infiltrate, proliferation of endocapillary, extracapillary and mesangial cells, podocyte foot process effacement, brush border detachment of tubular cells and abnormal mitochondria with ruptured cristae In relation to the control mice (C), the PT group showed increased proteinuria in the sixth month (PT: 57.0 ± 17.2 vs. C: 6.6 ± 2.4 mg/dL, p=0.012), higher degree of inflammation (%): 7.42 (5.31-8.43) vs. 0.51 (0.35-2.42); (p=0.001), and pro-oxidant (p=0.001), as well as antioxidant reduction (p=0.001), and increased expression of pro-fibrotic (p=0.009), apoptosis (p=0.009) and pro-oxidant markers. In the ultrastructure, podocyte pedicels, apoptotic mesangial cells and abnormal mitochondria with ridges rupture were observed, together with suppression of podocin mRNA (p<0.001), podoplanin (p=0.009) and α3β1-integrin (p=0.005). Treatment with quercetin induced nephroprotection in the PT-Q group when compared to PT, where a significant reduction in proteinuria (3.4 ± 2.0 mg/dL, p<0.001) was observed in the inflammation score [4.23 (2.12-6.94), p=0.041], on the expression of IL-6 (p=0.016), TNF-α (p=0.007), TGF-β1 (p=0.003) and Bax (p=0.006). Simultaneously, quercetin significantly increased CAT expression (p=0.001) and SOD1 (p=0.003). In addition, there was a partial recovery of the renal ultrastructure in the EM, and a higher expression of podocin mRNA (p<0.001) (but not of podoplanin and α3β1-integrin), in relation to the levels found in C group. In melatonin groups, the PT group presented higher inflammation score regarding to the C group (3.49% vs. control 0.83%, p<0.05), in the total collagen deposition rate (2.50% vs. 0.20%, p<0.05), reduction of the expression of the antioxidant enzymes (SOD1: p=0.003, CAT: p=0.012) and increased expression of IL-6, Bax and TGF-β1 (p<0.05 for all) Compared to the pristane-induced mice, the melatonin group presented a reduction in the inflammation score (3.49% vs. 1.2%, p<0.05), in the interstitial fibrosis index (vs. 0.36%, p=0.018), increased expression of antioxidant enzymes (SOD1: p=0.008, CAT: p=0.001) and decreased expression of IL-6, Bax, and TGF-β1 (p<0.05 for all). A lower degree of podocyte foot process effacement, thickening of the basement membrane and abnormal mitochondria were observed in the EM. Conclusion: These results provide evidence that quercetin and melatonin partially restore the structural changes of LN in the pristane-induced mouse model, modulating inflammation, oxidative stress, apoptosis and pro fibrotic markers, as well as expression of mRNA from podocyte proteins and its ultrastructure. Based on these findings, we consider that these natural substances may be an alternative therapeutic strategy to minimize renal injury in LN.