Caracterização de vesículas extracelulares e tráfego de antígeno B no contexto da infecção pela forma de Echinococcus spp.

Abstract

Echinococcus granulosus e Echinococcus ortleppi são agentes etiológicos da hidatidose cística. A doença é decorrente do desenvolvimento do estágio larval, o cisto hidático, no interior das vísceras do hospedeiro, principalmente fígado e pulmões. Os cistos hidáticos tem uma estrutura unilocular e preenchida por fluido, que contém os produtos de excreção/secreção do parasito. Os produtos de excreção/secreção têm um importante papel na interação parasito-hospedeiro e constituem potenciais alvos para diagnóstico, drogas antiparasitárias e vacinas. Diversos estudos têm ressaltado a importância de vesículas extracelulares (EVs) na comunicação intercelular de helmintos parasitas. O Antígeno B (AgB) é um produto de excreção/secreção cujo envolvimento na imunoevasão e captura/transporte de lipídios é conhecido em Echinococcus spp. O objetivo deste estudo foi investigar a relação parasito-hospedeiro no contexto desses dois importantes produtos de excreção/secreção de Echinococcus spp.: as vesículas extracelulares e o Antígeno B. Combinando ensaios de inibição de endocitose e colocalização, nós encontramos que a endocitose mediada por rafts lipídicas é a principal via envolvida na internalização de AgB por células in vitro. A via de endocitose mediada por vesículas de clatrina também pode contribuir para a internalização do AgB, porém em taxas menores. EVs de E. granulosus e E. ortleppi foram isoladas de líquido hidático e sobrenadantes de cultura de protoescólices por ultracentrifugação. A presença de EVs nas preparações foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão e NTA (nanoparticle tracking analysis), que mostraram a maioria das EVs com um diâmetro em torno de 100 nm. Uma linhagem de hepatócitos (RH) foi capaz de internalizar as EVs de Echinococcus spp., confirmando seu potencial para interação com o hospedeiro na hidatidose cística. A análise proteômica mostrou que a variabilidade no conteúdo de EVs entre cistos da mesma espécie é um traço comum em E. granulosus e E. ortleppi. Na comparação entre as duas espécies foi observada maior diversidade de proteínas em E. granulosus. As proteínas identificadas podem ser essenciais para a sobrevivência de Echinococcus spp., e algumas, como enolase, 14-3-3 e Antígeno 5, já foram sugeridas tendo papel nas interações parasito-hospedeiro. Adicionalmente, nós detectamos mRNAs nas preparações, indicando que essa classe de biomoléculas também integra as EVs de Echinococcus spp. O entendimento dos mecanismos associados às atividades do AgB e dos agentes moleculares nas EVs levará a uma melhor compreensão da relação Echinococcus-hospedeiro.

Echinococcus granulosus and Echinococcus ortleppi are aetiological agents of cystic hydatid disease (CHD). The disease is caused by the development of the larval stage, the hydatid cyst, at visceral sites, mainly liver and lungs. Hydatid cysts are fluid-filled, unilocular structures that contains the parasite excretory/secretory products. The excretory/secretory products have an important role in the host-parasite interplay and constitute potential targets for diagnosis, anti-parasitic drugs and vaccines. Several reports have highlighted the importance of extracellular vesicles (EVs) in helminth parasites intercellular communication. Antigen B (AgB) is an excretory/secretory product known to be enrolled in both immunoevasion and lipid uptake/transport in Echinococcus spp. The objective of this study was to investigate host-parasite interplay in the context of these two important Echinococcus spp. excretory/secretory products: extracellular vesicles and Antigen B. By combining endocytosis inhibition and colocalization assays, we found that raft-mediated endocytosis is the major pathway involved in AgB uptake by cells in vitro. Clathrin-mediated endocytosis might also contribute to AgB internalization, but in a lesser extent way. E. granulosus and E. ortleppi EVs were isolated from hydatid fluid and protoscolex culture supernatant by ultracentrifugation. The presence of EVs in the preparation was confirmed by transmission electron microscopy and nanoparticle tracking analysis, that showed most of EVs are around 100 nm in diameter. A hepatocyte cell line (RH) was able to internalize Echinococcus spp. EVs, confirming their potential for host interaction in CHD. The proteomic analysis showed that variability in the protein content of EVs is a common trait among cysts from the same species in both E. granulosus and E. ortleppi. In the comparative analysis of the two species it was observed a higher diversity of proteins in E. granulosus EVs. The identified proteins could be essential for Echinococcus spp. survival and some, such as enolase, 14-3-3 and Antigen 5, had already been suggested playing a role in host-parasite interactions. Additionally, we detected mRNAs in the preparations, indicating that this class of biomolecules is also integrant of Echinococcus spp. EVs. The understanding of the mechanisms associated to AgB activities and the molecular players in the EVs will lead to a better comprehension of Echinococcus-host relationship.