Estratégias para o aumento na eficiência de produção de suínos geneticamente modificados

Abstract

Os animais geneticamente modificados (GM) são uma importante fonte de proteína e nutrição para a maioria dos seres humanos e desempenharão papel fundamental para satisfazer a crescente demanda por alimentos em uma população mundial cada vez maior. Existem atualmente várias técnicas disponíveis para a produção animais GM, sendo que a clonagem por transferência nuclear de célula somática (TNCS), desde o nascimento da ovelha Dolly, continua sendo a técnica padrão ouro para se obter animais transgênicos. Apesar da clonagem por TNCS estar estabelecida há mais 20 anos, a eficiência continua baixa, com variações entre as diferentes espécies já clonadas. Esta baixa eficiência é multifatorial, tendo como pontos-chave a qualidade do material biológico utilizado (oócitos), o processo de ativação química partenogenética e a reprogramação celular após a fusão da célula doadora com o citoplasma receptor. Vários intentos foram realizados para avaliar a qualidade oocitária de forma menos subjetiva. A exposição dos oócitos a uma solução hipertônica é uma das opções viáveis e com resultados promissores. A ativação química dos embriões reconstruídos deve ser feita de maneira mais fisiológica possível, tentando mimetizar os processos biológicos que ocorrem na fecundação. Existem várias outras técnicas disponíveis para a produção de animais GM, incluindo a introdução de transgene em embriões, dentre estas, a microinjeção e a eletroporação de zigotos. A última década experimentou uma revolução no desenvolvimento de métodos de edição gênica que permitem a introdução de alterações específicas em genomas complexos. Esta revolução se deu início com o uso de meganucleases, Zinc Fingers, TALENS e, mais recentemente, com o descobrimento do uso das CRISPRs. Este aumento na precisão das ferramentas de edição irá melhorar características dos animais de produção com base no genoma para a produção de alimentos. A genética de precisão também aumentará o desenvolvimento de biomateriais terapêuticos e modelos de doenças humanas como recursos para o desenvolvimento de terapias avançadas para pacientes. O uso das nucleases de edição, especialmente as CRISPRs, abriu um leque de possibilidade de outras técnicas para serem empregadas na edição sítio-dirigida, como a microinjeção citoplasmática e a eletroporação de zigotos. Este trabalho teve como objetivo aumentar a eficiência na produção embriões suínos utilizando a clonagem por TNCS selecionando os oócitos de maneira menos subjetiva, aumentando a eficiência na ativação partenogenética pelo uso de quelantes de zinco, e aumentando a produção e qualidade embrionária expondo embriões a um inibidor de desacetilase de histonas (Scriptaid), assim como de desenvolver um protocolo de eletroporação de embriões suínos funcional e repetível para a edição gênica em diferentes loci utilizando CRISPRs combinada com complexos ribonucleoproteicos.

Genetically modified (GM) animals are an important source of protein and nutrition for humans and will play key roles in meeting the growing demand for food in an ever-growing world population. There are currently several techniques available for the production of GM animals, but cloning by somatic cell nuclear transfer (SCNT), since the birth of Dolly, remains the gold standard technique for obtaining transgenic animals. Although cloning by SCNT was established more than 20 years, the efficiency in producing cloned animals remains low, with variations among the species already cloned. Such low efficiency is multifactorial, having as key points the quality of the biological material for use (oocytes), the parthenogenetic chemical activation process, and the cellular reprogramming after the fusion of the donor cell with the recipient cytoplasm. Several attempts have been made to evaluate oocyte quality in a less subjective and visual way as it is usually done. The exposure of oocytes to a hypertonic solution is one of the viable options with promising results. Also, the chemical activation of the reconstructed embryos should be done in a more physiological way, in an attempt to mimic the biological processes that occur after fertilization. Several other techniques are also available for the delivery of transgenes into embryos for the production of GM animals, among them, zygote microinjection and electroporation. The last decade has undergone a revolution in the development of methods for gene editing that allow the introduction of specific modifications into complex genomes. Such revolution began with the use of meganucleases, such as Zinc Fingers, TALENS and more recently, with the discovery and the use of CRISPRs. This increase in accuracy in the editing tools will improve animal traits for food production. Precision genetics will also enhance the development of therapeutic biomaterials and human disease models as resources for the development of advanced therapies for patients. The use of editing nucleases, especially CRISPRs, has opened up a range of possibilities for other techniques to be used in site-directed editing, such as cytoplasmic microinjection and zygote electroporation. This study aimed to increase the efficiency in the production of porcine embryos using SCNT cloning by selecting oocytes in less subjective ways, by increasing the parthenogenetic activation efficiency using zinc chelators, and by improving embryo production by exposing cloned embryos to a histone deacetylase inhibitor (Scriptaid), as well as by developing a functional and repeatable protocol for the electroporation of pig embryos for gene editing at different loci using CRISPRs combined with ribonucleoprotein complexes.