Caracterização de bactérias promotoras do crescimento vegetal associadas à cultura da canola (Brassica napus L.)

Abstract

O sistema radicular abriga uma ampla diversidade de bactérias que vivem no solo rizosférico ou colonizando endofiticamente o interior dos tecidos vegetais. Estes micro-organismos podem promover o crescimento das plantas, principalmente pela modulação dos níveis de fitohormônios e por favorecerem a aquisição de nutrientes, especialmente nitrogênio e fósforo (P). Também, como mecanismo indireto, inibem o crescimento de fitopatógenos. Por essas características, as PGPB (plant growth promoting bacteria) são agronomicamente empregadas como biofertilizantes ou agentes de biocontrole. A aplicação destes produtos biológicos tem um potencial elevado para aumentar a produção agrícola e reduzir o uso de fertilizantes químicos ambientalmente prejudiciais. O objetivo deste trabalho foi caracterizar as habilidades de promoção do crescimento vegetal e de biocontrole de bactérias provenientes de raízes de canola. Foram avaliadas trinta bactérias gram-positivas formadoras de esporos, pertencentes a quatro gêneros: Bacillus (24), Paenibacillus (4), Lysinibacillus (1) e Microbacterium (1). Esses micro-organismos foram capazes de fixar nitrogênio, sintetizar auxinas, solubilizar fosfato, produzir enzimas hidrolíticas e sideróforos. Cinco isolados apresentaram atividade antifúngica in vitro contra o patógeno de canola Sclerotinia sclerotiorum, e quatro desses isolados suprimiram o crescimento do fungo pela produção de compostos orgânicos voláteis (VOC). Os genomas das bactérias antagonistas foram sequenciados e três isolados (01TAZ, 08TAZ, 32PB) foram identificados como Bacillus safensis, um (7PB) como Bacillus pumilus e um (16PB) como Bacillus megaterium, usando métricas genômicas. Vários clusters gênicos de antimicrobianos e metabólitos secundários foram encontrados em comum no genoma dos isolados, usando a ferramenta de mineração de genoma antiSMASH. Esses grupos gênicos incluíram agrupamentos biossintéticos de lipopeptídeos, bacteriocinas e sideróforos. No entanto, nenhum tipo de lipopeptídeo antimicrobiano foi identificado por espectrometria de massas nos extratos das culturas bacterianas. Apesar dos resultados obtidos in vitro e do potencial genômico para o biocontrole, estes isolados foram incapazes de proteger a canola contra a infecção por S. sclerotiorum em condições de câmara de crescimento. A solubilização de P foi uma das características de promoção de crescimento vegetal mais comum entre os isolados. Essas bactérias foram triadas quanto à solubilização de diferentes fosfatos insolúveis: hidroxiapatita (Ca5(PO4)3(OH)), FePO4, AlPO4, e fosfato de rocha (RP). Seis isolados foram capazes de solubilizar hidroxiapatita e RP. Os três melhores (6PB, 20PB, 27PB) foram selecionados e melhor caracterizados. Essas bactérias foram identificadas como Paenibacillus graminis pelo sequenciamento do gene 16S rRNA e uso de métricas genômicas. Foi verificada a influência de fatores nutricionais, tais como a fonte de carbono, nitrogênio e P solúvel, sobre a eficiência de solubilização. As bactérias produziram exopolissacarídeos utilizando P insolúvel e também formaram biofilme sob condições de deficiência de P. Todos os isolados selecionados reduziram o pH do meio de cultura e produziram vários ácidos orgânicos, detectados por espectrometria de massas. Essas características constituem um possível mecanismo de solubilização de P. A análise do genoma dos isolados 6PB e 20PB revelou a presença de diferentes genes relacionados ao metabolismo e homeostase do P. Todas estas características destacam as bactérias avaliadas como potenciais candidatos a agentes de promoção do crescimento de plantas.

Plant root systems harbor a wide diversity of bacteria living in the rhizospheric soil or colonizing endophytically the inner tissues of plants. These microorganisms can promote plant growth, mainly by modulating phytohormone levels, and by favoring the acquisition of nutrients, especially nitrogen and phosphorus (P). They can also inhibit the growth of phytopathogens as an indirect mechanism of plant growth promotion. Due to these features, PGPB (plant growth promoting bacteria) are agronomically used as biofertilizers or biocontrol agents. The application of these biological products has an elevated potential to increase crop yields and reduce the use of environmentally harmful chemical fertilizers. The aim of this work was to characterize the plant growth promotion and biocontrol abilities of bacterial isolates from canola roots. The thirty evaluated gram-positive spore-forming bacteria belong to four genera: Bacillus (24), Paenibacillus (4), Lysinibacillus (1) and Microbacterium (1). These microorganisms were able to fix nitrogen, synthesize auxins, solubilize phosphate, produce hydrolytic enzymes and siderophores. Five isolates displayed antifungal activity in vitro against the canola pathogen Sclerotinia sclerotiorum, and four of these isolates were able to suppress fungal growth by volatile organic compounds (VOCs) production. The genomes of these bacteria were sequenced and three isolates (01TAZ, 08TAZ and 32PB) were identified by genomic metrics as Bacillus safensis, one isolate (7PB) as Bacillus pumilus and one (16PB) as Bacillus megaterium. Several antimicrobial gene clusters were found in common among the genome of the isolates using the genome mining tool antiSMASH. These gene clusters included lipopeptides, bacteriocins and siderophores biosynthetic clusters. However, no antimicrobial lipopeptide compound was identified by mass spectrometry in bacterial culture extracts. In spite of the in vitro results and the genomic potential for biocontrol, these isolates were unable to protect canola plants against S. sclerotiorum in growth chamber conditions. One of the most spread plant growth promotion traits among the isolates was phosphate solubilization. The microorganisms were screened for solubilization of different insoluble P sources: Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3(OH)), FePO4, AlPO4 and Rock phosphate (RP). Five isolates were able to solubilize Hydroxyapatite and RP. The three best isolates (6PB, 20PB, and 27PB) were selected and better characterized. These bacteria were identified as Paenibacillus graminis by 16S rRNA gene sequencing and genomic metrics. The influence of nutritional factors such as carbon and nitrogen sources or soluble P on their solubilization efficiency was evaluated. The isolates produced exopolysaccharide using P insoluble source and formed biofilm under P deficiency. All selected isolates reduced the pH of the culture medium and produced several organic acids, detected by mass spectrometry. These characteristics constitute a possible mechanism of phosphate solubilization. The genomic analyses of 6PB and 20PB isolates revealed the presence of different genes related to phosphate metabolism and homeostasis. All these features highlight the characterized bacteria as potential candidates for plant growth promotion agents.