O vírus da imunodeficiência felina (FIV) como vetor de transferência gênica para células de linhagem hematopoética e , estroma de medula óssea murina

Abstract

A família dos retrovírus tem sido usada como urna das ma1s importantes ferramentas de transferência gênica em estudos de terapia gênica. Recentemente, os lentivírus vêm ganhando crescente popularidade devido ao seu potencial de infectar células quiescentes. A busca de vetores mais seguros tem destacado a importância dos lentivírus de mamíferos não-primatas, sendo que o Vírus da Imunodeficiência Felina (FIV) surge como alternativa na construção de vetores com maior eficiência e segurança. Modificações na estrutura molecular do genoma desse vírus possibilitaram a infecção estável de células humanas, bem como ampliação do tropismo celular e estabilidade viral. Neste trabalho, vetores lentivirais baseados no FIY, codificando o gene repórter gfp e pseudotipados com a proteína de envelope VSV -G foram produzidos por cotransfecção transiente de células empacotadoras 293T com os plasmídeos empacotador, vetor e envelope, pelo método de coprecipitação com fosfato de cálcio. A presença de partículas virais infecciosas, bem como o titulo obtido, foi avaliada com titulação do vetor em células não transfectadas da linhagem 293T, com obtenção de títulos superiores a l 04_lll/r:nL. Os vetores foram capazes de transduzir células das linhagens hematopoéticas humanas K562 e\ Daudi, além de culturas prunárias de estroma de medula óssea murina, com eficiência bastante elevada. Os níveis de expressão do transgene obtidos foram reduzidos, ocasionando um aumento de duas vezes na fluorescência basal dos diferentes tipos celulares. A transferência gênica foi estável, com expressão da GFP durante todo o período de manutenção das culturas transduzidas. A viabilidade das células expostas ao vetor foi medida com ensaio do iodeto de propídeo, indicando urna pequena toxicidade associada ao procedimento em algumas linhagens celulares. Não foi possível a detecção de formação de recombinantes virais capazes de replicação independente pelo ensaio de resgate utilizado. Os resultados sugerem que o FIV pode ser utilizado como vetor de tranferência gênica para células humanas, embora certas modificações nos elementos presentes nas construções plasmidiais sejam necessárias para melhoria das características de segurança, eficiência e níveis de expressão obtidos.

Members o f the retrovirus family have been employed as one of the most important tools for gene transfer in gene therapy studies. More recently, lentiviruses are gaining popularity for their potential to infect quiescent cells. The search for safer gene vectors has emphasized the irnportance of lentiviruses from non-primate mammals, and the Feline Immunodeficiency Virus (FIV) is being explored for the construction of more efficient, safer vectors. Modifications in its genomic molecular structure have allowed the stable infection of human cells, as well as an increase on cell tropism and viral stability. In this work, lentiviral vectors based on FIV, coding for the reporter gene gfp and pseudotyped with the envelope protein VSV-G, were produced by transient cotransfection of the packaging cellline 293T with the packing, vector and envelope plasmids, using the calcium phosphate coprecipitation method. The presence of infectious viral particles, as well as the titre, were analyzed by titration of the vector on non-transfected 293T cells, with the obtention of titres higher than I 04 Ul/mL. The vectors were capable to transduce cells from the human hernatopoietic lines K562 and Daudi, besides primary cultures of murine bone marrow stroma, with high efficiency. The levels of expression of the transgene were relatively low, with a two-fold increase on the background fluorescence levei of the different cell types studied. Gene transfer was stable, and GFP was expressed through ali the period of maintenance of the transduced cultures. The viability of the cells exposed to the vector, analyzed witb the propidium iodide assay, indicated some toxicity associated to the procedure in some of the cells. The rescue assay employed was not able to detect the formation of viral recombinants capable of independent replication. The results suggest that FIV can be used as a vector for cell transfer to hurnan cells, although some modification on the elements present in the plasmidial constructs is necessary in arder to increase the safety, effi.ciency and levei of expression o f the transgene.